为了解决心脏早期细胞命运和形态发生的问题，2023年2月2日，来自旧金山Gladstone Institutes的Benoit G. Bruneau团队在Cell杂志上发表了一篇题为Graded mesoderm assembly governs cell fate and morphogenesis of the early mammalian heart的文章，他们利用四维全胚胎光片成像和改进的计算工具，以单细胞分辨率纵向重建了早期小鼠心脏发育过程。
研究人员首先使用光片荧光显微镜（LSFM）和鼠离体胚胎培养整合了来自Mesp1谱系和Smarcd3“F6”增强子（已知最早的心脏特异性标志物）的荧光报告基因的数据，对原始数据进行处理和单视图反卷积，采用BigStitcher工具来对齐并合并4D中的多视图LSDM数据后，对基于改进的高斯混合模型的目标追踪方法（F-TGMM v2.5）得到的轨迹进行分析并可视化实时成像数据（图1）。利用这一工具箱，作者分别检查Mesp1谱系和带有Smarcd3-F6-nGFP报告基因的小鼠胚胎，观察到中胚层从前近端到后远端的顺序发生组装以及Smarcd3-F6+祖细胞的迁移轨迹，并给出不同阶段Mesp1+和F6+细胞对不同心脏结构的贡献。
对于心脏新月如何转变为封闭的线性心管（linear heart tube, LHT）人们仍了解不多，研究人员在此处发现细胞形状和大小等形态学变化类似于间充质上皮细胞转变（MET），支持这一猜想的证据是他们发现心脏新月中的上皮细胞标志物CADHERIN信号增加，且与α-CATENIN共定位量化增加。在形成上皮细胞（E7.75）后不久，心脏祖细胞会快速形成闭合心管（E8.25），期间能观察到两种显著的运动模式，首先，上皮层背侧的祖细胞脱离心内膜表面，导致脊的腹前部分在FHF（第一生心区，first herat field）/JCF（juxta-cardiac field）边界上旋转，JCF沿着脊的腹向扭转并整齐地覆盖在心脏上皮的腹侧（模式1），随后旋钮状上皮突起在新月背侧呈波浪状向后传递（模式2），SVF重建和Mef2cAHF谱系追踪实验的延时成像证明这两种模式是SHF（第二生心区）的特征，两种模式分别导致早期心管的开闭（图1）。在用MEF2C+（JCF、FHF 和 SHF）和Mef2cAHF谱系（仅限SHF）细胞标记的胚胎中，研究人员观察到SHF祖细胞通过波状易位或旋钮状上皮结构进入正在形成的线性心管。随后，作者发现ISL1和NKX2-5表达是SHF旋钮样结构的特征并构建了两者各自的突变体胚胎，ISL1突变会导致该旋钮样结构的缺失，进而引起心管保持开放状态。
之前已有工作通过敲低实验对Mesp1进行了体外研究，研究人员在这项工作中观察到Mesp1 KO中胚层的前侧没有达到前中线，根据之前确定的从前近端到后远端的组装顺序对F-TGMM轨迹进行观察发现运动梯度得以在突变体中保留，但密度梯度出部分倒置，这些轨迹的空间矢量结果显示Mesp1突变体的前向运动和向外扩张运动存在严重缺陷。为了了解定向迁移失败的可能机制，作者对Mesp1 KO胚胎进行scRNA-seq分析，中胚层祖细胞中大量形态发生素和它们的受体以及下游信号效应器受到Mesp1缺失的影响，其中Rac1和Fgf基因已被证明对中胚层的定向运动很重要。对Mesp1 KO胚胎中的单个轨迹的检查显示，较早出生的前部细胞几乎没有前向运动，而较年轻的后部细胞保持一定程度的前向运动，这种异常运动可能是观察到的密度梯度反转的基础，因为它导致细胞聚集在胚胎中间而非前近端。因此，方向性而非运动性可能是导致Mesp1突变体中胚层紊乱的罪魁祸首。
图2. Mesp1的缺失破坏了原肠胚形成后形成的密度梯度并改变了中胚层结构。
总的来说，这项工作通过将离散的形态事件按顺序与精细的空间和时间分辨率相联系，检查了小鼠从E6.5到E8.0这个短暂、关键且高度动态的发育窗口，揭示了早期心脏特定区域形成如何与祖细胞的出生和迁移行为密切相关，这些发现对心脏特异性但可能具有胚胎发育普适性的细胞分配特征做出了重要贡献。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.01.001
