确保基因编辑过程中的基因组安全对于高效CRISPR-Cas9工具箱的临床翻译至关重要。因此，治疗性基因编辑过程中出现的包括染色体易位、载体整合和大量缺失等不希望发生的事件仍有待在体内充分解决或处理。
2022年12月22日，北京大学胡家志及中国科学院神经科学研究所杨辉共同通讯在Nature Communications发表题为“Safeguarding genome integrity during gene-editing therapy in a mouse model of age-related macular degeneration”的研究论文，该研究应用CRISPR-Cas9TX与CRISPR-Cas9进行比较，在小鼠模型中靶向Vegfa治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)疾病。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas9TX的AAV递送都能有效抑制激光诱导的新生血管。
重要的是，Cas9TX几乎消除了在Cas9编辑的小鼠视网膜细胞中以大约1%的频率发生的染色体易位。引人注目的是，在Cas9TX编辑期间，广泛观察到的目标Vegfa位点上的AAV集成也从近50%的编辑事件大幅降低到后台水平。研究结果表明，在体内基因组编辑过程中，染色体结构变化经常发生，并强调Cas9TX是Cas9在体内基因破坏中的优越形式。
腺相关病毒介导(AAV) Cas9靶向显示出在体内治疗复杂疾病的巨大潜力。然而，使用AAV交付的CRISPR-Cas9进行体内治疗在安全性方面仍然面临着巨大的障碍，包括潜在的意外改变，如染色体结构变异和AAV整合。在培养细胞中，染色体结构变异的频率可达10%，但在体内仍缺乏对终分化细胞的编辑安全性的全面评估。此外，最近有报道在体内CRISPR-Cas9编辑过程中，包括AAV和质粒载体在内的外源性DNA以高达47%的频率整合到基因组中，同时也缺乏避免载体整合的解决方案。
出于安全考虑，这些不必要的编辑副产品可能会在基因组编辑过程中引发意想不到的后果。在这方面，染色体易位与肿瘤发生有关，包括但不限于白血病、前列腺癌、乳腺癌和尤因肉瘤。整合的DNA元件可能会影响邻近区域的基因表达，这也可能会增加编辑细胞发生肿瘤的风险。因此，评估和消除体内不良编辑事件对于CRISPR-Cas9的临床转译非常重要，迫切需要一种切实有效的解决方案来减少体内基因组编辑过程中的染色质结构变异和外源性DNA整合。
老年性黄斑变性(AMD)是导致失明的主要原因，大约三分之二的80岁以上的老年人口有AMD的迹象。抗血管内皮生长因子A (VEGFA)药物是湿性AMD的主要治疗药物，包括小分子(pegaptanib)和抗体(aflibercept)。这些策略显示出前所未有的疗效，但由于反复注射，有引起局部并发症的风险。近年来，CRISPR-Cas工具箱已被用于靶向VEGFA治疗AMD，其中CRISPR-Cas9已被多个研究组成功用于激光诱导脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型中破坏VEGFA。通过视网膜下注射Cas9和通过核糖核蛋白(RNP)或腺相关病毒(AAV)的单导RNA (sgRNA)，可以有效地抑制小鼠眼睛激光诱导的新生血管。
通过抑制重复切割，Cas9TX已被报道在体外有效地消除编辑细胞中的染色体易位，但Cas9TX在体内保护基因组完整性的能力仍然缺乏。在这里，研究者应用Cas9TX在小鼠模型中有效地治疗AMD。Cas9TX不仅能极大地抑制染色体易位，还能抑制AAV在靶位点的整合。研究结论Cas9TX是更好的选择，而不是Cas9在体内基因编辑。
体内基因组编辑过程中的染色质结构变异（图源自Nature Communications）
因此，Cas9TX应该可以兼容几乎所有适用于Cas9的基因编辑场景，在同等的编辑能力下，安全性更高。
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35640-4
