2022年12月22日，来自德国马克斯·普朗克生化研究所的Matthias Mann和来自组织工程与再生医学研究所的Ali Ertürk合作，共同在Cell上发表了题为Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens的文章，他们开发了一种新的空间蛋白组学技术DISCO-MS（3D imaging of solvent-cleared organs profiled by mass spectrometry），并将其应用于从完整小鼠和人类器官分离的目标区域的空间分子图谱绘制，同时作者开发了一套机械组织提取系统DISCO-bot，能用于挑战性样本如整只成年小鼠及完整人类器官的样本提取。DISCO-MS和DISCO-bot的结合能对小组织区域进行无偏倚的空间蛋白组学分析，文章研究了完整小鼠骨髓生态位组织和人类心脏动脉斑块的异质性。
组织透明化涉及组织通透和生物分子的提取等化学过程，为研究组织蛋白组在这些步骤后是否发生变化，作者采用MS对表达蛋白进行组分、结构和功能分析，发现SDS蛋白溶解和组织粉碎后使用SDS进行再溶解和蛋白消化能产生高质量的，与新鲜组织非常接近的蛋白质组。3DISCO和uDISCO是用得最多的透明化方法，对于荧光染色成像效果很好，但是内源荧光蛋白信号却不稳定，为此，作者开发了vDISCO，利用荧光染色共轭的纳米抗体来稳定和增强荧光信号。类似的，作者也对其进行了蛋白质组学鉴定，发现vDISCO的额外步骤也不影响蛋白质组，可以适用于小鼠和人类样本，获得与新鲜和多聚甲醛固定样本同等的深度和准确性，且技术的重复性很好（图1）。
接下来，作者开始对3D成像和定位的小的靶向组织区域（~0.0005 mm3）进行无偏倚的蛋白质组分析。在此过程中，作者做了以下三方面的改进：1.颠倒透明化步骤，对透明化组织进行再水化后冷冻保存，从而实现小组织区域的稳定消化解剖；2.将样本制备流程小型化，在单细胞高灵敏度水平进行基于MS的蛋白组分析，实现纳克级别的组织蛋白质组学研究；3.实现了2D激光捕获显微切割和3D光片成像的对应匹配（图2）。作者在创伤性脑损伤（mTBI）小鼠模型中对含有局部分散炎症的区域进行了蛋白组学分析，视束中已知空间信息的3个感兴趣的区域（regions of interest, ROIs）的结果证实了技术的应用潜能，能够在异质性组织区域获得无偏倚的蛋白质组学信息。
阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease, AD）的一个早期特征是淀粉样蛋白β（Aβ）斑块的沉积，作者于是想利用DISCO-MS对其进行蛋白组学分析，从而获得对AD早期阶段的新见解。在5xFAD小鼠模型中，作者首先开发了一种深度学习方法来鉴定所有斑块的位置，验证其准确性后，作者将数据映射至艾伦大脑图谱，获得了超过1,000个脑亚区的区域量化数据，在将其分组至主要的脑区后，作者得到了疾病早期和后期每一个区域的斑块体积，并标注了27个疾病相关的区域（图3）。在后期，丘下区和海马后区的斑块数目显著上升，最大的斑块在中脑区域，有趣的是，中脑、听觉区域等地的斑块体积会在6个月时显著减小，提示斑块表型的时空改变，这可能是微环境有害效应或疾病进展导致的。同样地，作者分离出了4个ROIs并在这些区域发现了许多AD相关蛋白的富集，定义了一个早期Aβ斑块形成的核心蛋白质组。通过比较斑块区域和邻近的无斑块区域，作者发现与囊泡融合与转运，分泌途径相关的蛋白存在显著数量变化，提示其可能是早期AD起始标志，已知斑块相关蛋白的上调具有区域特异性，而这一概念由于之前技术的限制没有得到很好的探索。
随后，作者将DISCO-MS应用至全小鼠及全人类器官等更大的样本类型中，并适应需求开发了机械提取系统DISCO-bot。同样，作者做了三方面的改进：1.用2%的琼脂糖包埋来稳定机械提取的全小鼠；2.用3D打印定制的鼠标夹适配器和针夹来减少提取过程中发生的偏转；3.针号口径为18或22的样本穿透和组织提取效果最好，能最大程度减少不需要组织的污染。作者还进一步优化，使得DISCO-bot能与数字扫描激光显微镜协作，在成像时提取透明化组织的小组织区域，进行非破坏性的可重复的组织分离，用于DISCO-MS研究（图4）。作者将其应用至LysM-eGFP小鼠中，经由DISCO-bot提取的ROIs分析证明了提取的高度准确性，DISCO-MS能够用于全成年小鼠生物体成像后的空间分子异质性和生物学多样性研究。
最后，作者将DISCO-bot辅助的DISCO-MS方法应用至人冠状动脉疾病（coronary artery disease, CAD）中，作者获得了多聚甲醛固定的人类心脏，使用SHANEL人类器官透明化技术将整个心脏透明化。他们分别在大的斑块相关区域和小（无）斑块区域提取了6个ROIs，发现在早期冠状动脉斑块形成过程中，心脏肌肉收缩、血液凝固等途径相关蛋白表达上调，其中一些是区域特异性的，鉴定了MYH8等具有生物标志物潜能的蛋白，同时作者发现MACROH2A.1组蛋白的显著减少，而其在调节自噬和胆固醇外流中被研究得很少。
综上，文章提出了一种全新技术DISCO-MS，它结合了全器官/全生物体透明成像，深度学习为基础的成像分析，机械组织提取和超高灵敏度质谱分析，绘制了小于100个细胞的透明化组织样本的蛋白组，且其在啮齿动物和人类组织中获得的蛋白质组数据与未进行组织透明化的样本难以区分。DISCO-MS能够对3D全样本成像后的临床前和临床组织进行无偏倚的蛋白质组学分析，从而为复杂疾病提供更多诊断和治疗机会。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.11.021
