Nature | CRISPR-Cas9基因编辑系统R-loop形成和活化的结构基础

2022年8月24日,来自瑞士苏黎世大学的MartinJinek实验室在Nature发表题为R-loop formation and conformationalactivation mechanisms of Cas9的论文。文章利用冷冻电镜对CRISPR-Cas9系统R-loop形成的机制进行了全面系统的分析,并揭示了Cas9核酸酶活化的结构基础,这为降低脱靶改善CRISPR-Cas9系统的安全性提供了新的见解。


Nature | CRISPR-Cas9基因编辑系统R-loop形成和活化的结构基础
研究者指出,PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6bp便可保障CRISPR-Cas9系统形成稳定的R-loop结构。随后通过分析PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6、8、10、12、14bp时所形成的SpCas9-sgRNA-DNA复合物结构,研究者发现R-loop形成过程中构象变化最显著的结构域为REC2、REC3和HNH三大结构域。

PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为6bp时,sgRNA首先与互补的靶标DNA单链(简称为TS DNA)形成5bp的sgRNA-DNA杂合双链,更长杂合双链(>5 bp)的形成则被Cas9的Y450氨基酸阻碍。研究还发现,杂合双链与REC2结构域构象变化密切相关。PAM远端的DNA双链会被REC2/3结构域形成的正电缝隙锚定,其中REC2的多个位点(S219、T249和K263)可结合NTSDNA而REC3的多个位点(R586和T657)则结合TS DNA。此外,R-loop形成的初始阶段,NTS发生重定位并与RNA-TS DNA杂合链平行,而sgRNA的5’末端则位于HNH与PI结构域形成的正电缝隙中。
PAM近端sgRNA-DNA互补序列长度为8bp时,Y450便难以阻挡>5bp的sgRNA-DNA杂合双链形成。此时REC2和REC3结构域的构象进一步改变,Cas9蛋白REC2及REC3的其它位点也会结合PAM远端的DNA双链。

考虑到Y450在R-loop形成中的关键作用,研究者对Y450A突变后Cas9的脱靶风险进行分析。结果显示Y450A能显著降低Cas9对脱靶位点的切割速率从而提高其特异性。研究还指出,与包含PAM远端碱基错配的脱靶位点相比,包含sgRNA核心区(PAM近端10bp称为核心区)碱基错配的脱靶位点更难以形成稳定的R-loop结构,且受Y450A突变影响更大,脱靶风险更低。

当sgRNA-DNA互补序列长度为10bp时,PAM远端的DNA双链会发生重定位,被REC3、RuvC和HNH结构域形成的正电中央结合通道锚定。此时,PAM远端的DNA双链会与sgRNA-TS DNA杂合链形成连续的碱基堆积,被sgRNA置换出的NTS DNA单链则位于HNH结构域下方并与RNA-TS DNA杂合链平行。更深入分析发现,PAM远端的DNA双链是楔入REC3、RuvC和HNH的 L1连接区中间,这也导致REC2结构域发生位移并掩蔽TS DNA的切割位点。REC2位移也导致REC2的负电螺旋区(简称DDD螺旋)与REC3的正电螺旋区(简称RRR螺旋)形成新的静电互作。研究还指出,REC2的DDD螺旋核心氨基酸的丙氨酸突变能有效降低脱靶位点的体外切割效率,而REC3的RRR螺旋核心氨基酸的丙氨酸突变只能降低包含sgRNA核心区错配的脱靶位点的切割效率。由此可知,REC2-REC3互作对R-loop形成过程中Cas9的结构重塑很重要。

在sgRNA-DNA互补序列长度为6bp、8bp或10bp时,HNH核酸酶结构域被RuvC和PI结构域包裹,且活性区被掩蔽。R-loop区杂合链达到12bp时,REC2/3以及PAM远端的DNA双链构象保持稳定,但HNH结构域开始丢失稳定性。当R-loop区杂合链达到14bp乃至16bp时,HNH结构域发生明显位移并靠近sgRNA-TS DNA形成的杂合链区域。PAM远端的R-loop形成时,RuvC结构域的环状结构会重塑并与L2连接区互作,进而促进L2的位移和HNH的重定位,并导致中央结合区的关闭。不过此时HNH结构域仍处于失活状态。

已知PAM远端4bp错配会抑制Cas9的酶切活性,而仅第19、20碱基有错配的位点则能被Cas9有效切割。当R-loop区杂合链达到18bp时(1mM Mg2+),HNH结构域仍处于与16bp R-loop相似的失活态,而REC2和REC3结构域则处于与12、14、16bp R-loop相似的构象,这与早前的报道一致。之后研究者对活化状态的Cas9-sgRNA-DNA复合物进行分析,发现其在TS和NTS的切割位点与已有报道一致。但与已有报道不同的是,新结果发现,NTS DNA单链切割后,PAM近端的NTS仍被RuvC活性位点结合,此时REC2发生位移并远离TS切割位点,HNH结构域则发生约140°旋转以切割TS DNA单链。以上的构象改变能被PAM远端的sgRNA-TS DNA杂合链弯曲及REC3重定位所促进。研究还指出,L1和L2连接区的重构导致了HNH旋转,最终导致NTS结合缝隙拓宽和RuvC活性区的暴露。综上可知,R-loop的形成与HNH结构域重定位以及RuvC活性区的暴露是偶联的,这也与已有的单分子研究吻合。

总体而言,系统性的结构分析指出,CRISPR-Cas9活化过程中,R-loop的形成与核酸酶活化所必须的结构域重构之间存在多重偶联的关系。R-loop形成的初始阶段,REC2/3结构域可锚定靶位点DNA双链的末端,R-loop的中后期会促进REC2/3的重构及HNH核酸酶结构域的重定位,形成一种失活检查点的构象。R-loop达到完成态后会诱导HNH的活化,sgRNA-TS DNA杂合链的扭曲以及REC2/3重构。本研究厘清了Cas9活化的结构基础,也为CRISPR-Cas9基因编辑系统的深度优化提供了新的方向和思路。

原文链接
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05114-0

版权声明:Robin 发表于 2022年8月27日 pm9:40。
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