NBT(IF=68)| 突破!杨辉团队开发出高保真Cas13蛋白变体,加速RNA编辑工具应用

CRISPR–Cas13 系统最近已被用于各种生物体中的靶向 RNA 降解。然而,周围的任意RNA(bystander RNA) 的旁切效应限制了它们在体内的应用。

2022年8月11日,辉大基因/中国科学院神经研究所/上海脑科学与类脑研究中心杨辉团队(辉大基因为第一单位)在Nature Biotechnology(IF=68)在线发表题为“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”的研究论文,该研究设计了一个双荧光报告系统,用于检测哺乳动物细胞中的旁切效应和筛选 Cas13 变体。

在 200 多种工程变体中,包括 Cas13d 和 Cas13X 在内的几种 Cas13 变体表现出有效的靶向活性,但旁切活性显著降低。此外,这些变体不存在由 Cas13 诱导的转录组范围的脱靶和细胞生长停滞。高保真 Cas13 变体显示出与野生型 Cas13 相似的 RNA 敲低活性,但在转基因小鼠或腺相关病毒介导的体细胞靶向中没有可检测到的旁切损伤。因此,具有最小旁切效应的高保真 Cas13 变体现在可用于基础研究和治疗应用中的 RNA 靶向降解。

NBT(IF=68)| 突破!杨辉团队开发出高保真Cas13蛋白变体,加速RNA编辑工具应用

CRISPR 和 Cas 系统能够在各种类型的细胞和生物体中进行基因组编辑。CRISPR–Cas13 是 2 类 VI 型 RNA 核酸内切酶,具有两个 HEPN结构域,用于 RNA 切割,为大肠杆菌提供针对裂解单链 RNA MS2 噬菌体的可编程免疫,并已用于 RNA在真核细胞中进行操作。基于它们对靶 RNA 的天然 RNase 活性,以及体外非特异性单链 RNA 的旁切效应,Cas13 蛋白最近被用于核酸检测。

Cas13 蛋白家族已被证明在可编程 RNA 靶向方面具有高效率和特异性,并已广泛用于酵母、植物、果蝇、斑马鱼和哺乳动物中 RNA 的切割和随后的降解。CRISPR–Cas13d 的直系同源物 RfxCas13d(也称为 CasRx)可以在体内介导 RNA 敲低并有效缓解各种小鼠模型中的疾病表型。因此,靶向 RNA 的 CRISPR-Cas 系统为转录组工程在基础研究和治疗应用中提供了一种有前景的方法。

然而,CRISPR-Cas13 系统的体内应用受到潜在的旁切效应的阻碍(Cas13 一旦通过与目标 RNA 的相互作用而被激活,就会降解周围的任意RNA(bystander RNA)),这是 CRISPR-Cas 免疫的基本特征之一。最近,在果蝇、哺乳动物细胞和哺乳动物中发现了由 Cas13 诱导的旁切 RNA。因此,Cas13 系统的体内应用需要对旁切RNA活性及其消除进行综合分析。

NBT(IF=68)| 突破!杨辉团队开发出高保真Cas13蛋白变体,加速RNA编辑工具应用

使用双荧光报告器评估瞬时转染的 HEK293T 细胞的旁切效应(图源自NatureBiotechnology

以前的结构研究已经确定了旁切RNA的机制。在 Cas13 与靶 RNA 结合后,两个 HEPN 结构域会发生明显的构象变化,从而在蛋白质表面形成催化位点,可以随机降解靶和非靶 RNA,这一过程称为顺式/反式切割。然而,目前尚不清楚在活化的 Cas13 的催化位点附近是否存在针对靶标和非靶标 RNA 底物的任何不同的结合位点。如果存在这样的位点,则可以通过诱变 Cas13 选择性地去除非目标 RNA 结合,从而消除旁切效应。

该研究建立了一个快速灵敏的双荧光报告系统来检测旁切效应,发现当靶向外源性或内源性基因时,Cas13 可以在 HEK293T 细胞中诱导显著的旁切效应。此外,该研究设计了许多在 HEPN 结构域中具有突变的变体,并发现了几种具有显著降低的旁切活性和相当的靶向切割效率的变体。

当使用突变的 Cas13 变体 Cas13d-N2V8(967 个氨基酸)或 Cas13X-M17YY(775 个氨基酸)进行编辑时,转录组范围的 RNA 测序 (RNA-seq) 和细胞增殖分析所揭示的旁切效应基本消除。因此,通过诱变减少或消除混杂的 RNA 结合,该研究获得了几种用于靶向 RNA 降解的高保真 Cas13 变体,具有最小的旁切效应。

参考消息:

https://www.nature.com/articles/s41587-022-01419-7

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