单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制

文章信息

文章题目Single-cell profiling of human bone marrow progenitors reveals mechanisms of failing erythropoiesis in Diamond-Blackfan anemia
期刊:SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE
日期:2021年9月
DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abf0113

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制

罕见病的单细胞分析文献,这篇看看对你类似的工作有思路启发哦!

这篇文献基于基因组突变和临床表型的差异对RPS-DBA与RPL-DBA类型病人的骨髓CD34+细胞进行单细胞转录组分析,并构建体外细胞模型进行验证。挺难的,从背景走起~

背景介绍

Diamond-Blackfan贫血(DBA) 是一种罕见的遗传性核糖体病(核糖体蛋白突变),特征是贫血、多系统先天性异常及癌症易感性。大约 75% 的 DBA 病例是由编码包含大60S (RPL) 或小 40S (RPS) 核糖体亚基的蛋白中单基因的杂合突变引起的。核糖体合成缺陷和过度血红素毒性导致红系/巨核细胞 (MK) 转录因子GATA1的转录/翻译受损,被认为是 DBA 红细胞衰竭的机制。然而,人类的细胞模型和细胞系模型得到不一致发现,尚不清楚是否有其他机制导致 DBA 中的红系衰竭。

在这里,作者使用来自患者的原代骨髓样本利用10X 单细胞测序技术描绘了 RPS-DBA 和 RPL-DBA 的细胞和分子景观。旨在阐明 RPS-DBA 和 RPL-DBA 红细胞生成之间的表型和功能差异、红细胞衰竭的机制以及它们与临床表型的关系。

结果

在 RPS-DBA 而非 RPL-DBA 患者的骨髓中观察到严重的红谱谱系损害

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制Figure 1ABC

使用 10x Genomics 平台对骨髓 CD34+ 谱系HSPC 进行了scRNA-seq(图 1A)。共研究 6 名患有红细胞输入依赖型 DBA 患者(年龄 2 至 19 岁),DBA 基因型为四种常见中的三种—— RPS19 (n = 3)、RPL11 (n = 1) 和 RPL5 (n = 2)和三名健康者(3 至 17 岁)。质控后共有41 415单细胞,它们的分群图如图1B,共有19个细胞群。各细胞群的marker在图S1B,图片太大,放这里看不清。(附链接:【https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.abf0113】,大家点击下载看吧)通过使用包含高谱系特异性经典marker·的六个基因集计算谱系评分,进一步将细胞注释成了6大类:E 和 EP(EP);MK 和 MK 祖细胞 (MKP);单核细胞/巨噬细胞/中性粒细胞祖细胞(MyP);淋巴 (Ly) 和 Ly 祖细胞 (LyP);嗜酸性粒细胞、肥大细胞/嗜碱性粒细胞祖细胞 (EoMBP);造血干细胞/多能祖细胞 (HSC / MPP)。分化轨迹的力导向图如figure1C。

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Fig.S1.AB

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Figure 1D

通过不同分组的 circos 图群揭示了 DBA 中两种不同的祖细胞模式,(图 1D):RPS-DBA中 EP 和 MKP选择性丢失,但在 RPL-DBA 中这些祖细胞保留,与正常骨髓具有相同的细胞状态和结构。

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为了独立验证这个发现,作者利用多参数流式分选的技术额外从23个正常组(control)及25个DBA病人中分选了骨髓中CD34的谱系细胞。证实在 RPS-DBA 中免疫表型为 CD38和 CD38 的EP 和 MKP(定义为 CD34+CD45RA-CD71+)显著减少,而 EP 和 MKP 在 RPL-DBA 中大部分保留(图 1E和F)。其他谱系细胞及CD34细胞比例在对照、RPS-DBA、RPL-DBA中无显著变化。表明,在 RPS-DBA 中,EP/MKP 与 EoMBP 命运决定下游的 EP 和 MKP 耗尽,而在 RPL-DBA 中,EP 和 MKP 相对保留。

从 RPS-DBA 和 RPL-DBA 患者分离的原代 HSPC 表现出不同的EP分化程序

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Figure 2AB

为了刻画 EP 和 MKP 内的谱系关系,作者对对 6 380 EP 和 MKP 细胞进行了进一步的 细胞亚群聚类(图 2A 和 B)。四个 EP 和 MKP 亚群的marker基因如图 2B ,亚群 1 富含早期红细胞发育的基因marker(CSF2RB);亚群 2为MKP 群;亚群 3表达 红细胞分化血红蛋白 (HB) 基因及其 AHSP 分子;亚群 4 表达与红细胞周期相关控制基因 (AURKB)。

作者们专注于E 和 MK 关键转录因子的表达(图 2C 和图):GATA2,它作为早期 EP(EEP 或 BFU-e)marker, 在晚期 EP(LEP 或 CFU-e) 阶段会下调;GATA1 ,从EEP到 LEP会上调;KLF1 和 FLI1,它们相互拮抗以确定 E 与 MK 细胞的命运。

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Figure 2DEF

再次比较这些细胞群在不同类型样本的比例,发现的EP 和 MKP亚群在 RPS-DBA 中都减少(图 2D)。相比之下,RPL-DBA 中的EP 和 MKP 亚群频率与正常骨髓相似,表明DBA 基因型存在不同的红细胞分化轨迹(图 2D)。与对照相比,GATA2(不是 GATA1 或 KLF1)在所有 RPS-DBA 亚群中增加,FLI1 表达在 EEP 和 LEP 中增加(图 2C),与红系表型型表现阻滞一致。通过绘制单个 EP / MKP 细胞中的 FLI1 和 KLF1 共表达(图 2E)进一步探索,揭示了 KLF1 在 RPL-DBA 中有较高比例且在 EP / MKP 中的表达高于 FLI1,这与KLF1 驱动的红系程序一致。

在 RPS-DBA 中 EP所有发育阶段的细胞都逐渐减少,但这些细胞群却在 RPL-DBA 中保留。这种差异在 LEP 细胞群中尤为显著,而在 RPS-DBA 中几乎不存在LEP 细胞群(图 2F 和 G)。

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Figure 2GHIJKL

为了确定 RPS-DBA 与 RPL-DBA EP生成功能性红细胞的潜力,作者通过荧光分选了EEP在包含促红细胞生成素 (Epo)的细胞培养物中进行体外培养。尽管 DBA 样品的克隆效率正常,但在细胞集落中存在显著的质量差异。在 RPS-DBA 中,主要由小的 BFU-E形成的松散集落,而不是典型的大 BFU-E,正常对照 EEP 形成爆发式集落。相比之下,RPL-DBA EEP(图 2H 和 I)和总 CD34(图 S4C)产生高度异常的、小于 100 个细胞的小 CFU-E 样集落。单细胞的红细胞集落的吉姆萨染色也证实在异常RPL-DBA 集落中存在更成熟的 EB,而不是正常 BFU-E,表明分化紊乱。与此对应,分化相关基因 GYPA在 RPL-DBA LEP 中的表达高于正常或 RPS-DBA 对应物(图 2C)。此外,体外Epo 支持的液体培养物中,RPL-DBA 骨髓中的 HSPC 比 RPS-DBA(图 2J)有更高的红细胞产量,具有相似的凋亡率(图 S4E),但具有更高比例的成熟 EB (图 2K 和 L、图 S4F);与对照 HSPC(图 S4、G 和 H)相比,表达更高量的糖蛋白 A (GYPA) mRNA和蛋白质。这些发现表明:DBA 中存在不同的、基因型相关的红细胞衰竭模式,这些 BFU-E 在红细胞分化的过渡中表现是分化程序受损。

在RPL-DBA 中观察到表型正常的 EB

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Figure 3A

作者接下来研究了体内 RPS-DBA 和 RPL-DBA 之间的红细胞分化是否不同。首先,分选计算了DBA 骨髓样本中 Lin-CD34-CD71+EB 的频率(图 3A)。RPS-DBA 骨髓中的 EB 频率低于正常对照和 RPL-DBA。为了更精确地定义体内缺陷,使用流式细胞术来测量六个不同表型阶段(基于 CD105 和 GYPA 表达来定义)的频率。在 RPS-DBA 中用于分析的 EB 太少,但在 RPL-DBA 中确定了 与对照组骨髓中EB 发育的所有相同阶段(图 3B),在RPL -DBA中 EP 与 EB 发育的相对滞留。

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Figure 3BC

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Figure 3D

作者还比较了来自DBA 患者的 52 份骨髓的细胞计数差异(图 S6C),发现与对照组相比,两种基因型的 EB 均减少;但RPL-DBA骨髓的红细胞比例比 RPS-DBA高出约三倍(图 3C 和 D),髓系细胞频率低于三倍。这些发现在六个 RPS-DBA 和四个 RPL-DBA 基因型中一致(图 S6、D 和 E),证实了这个发现,即在 RPL-DBA 的祖细胞阶段后红细胞分化出现枯竭。

DBA 的特点是糖皮质激素通路——缺乏应激性红细胞生成和糖皮质激素诱导的红系分化受抑制

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Figure 4ABCDEF

作者还发现,与正常对照相比,胎儿血红蛋白(HbF;HBG2)的表达和表达 HBG2 的细胞比例在来自两种 DBA 亚型的所有三个 EP 亚群中(EEP,Ecyc,LEP)都较高,这与早期研究一致(图 4A)。与 HBG2 一样,其他应激性红细胞marker,如 ERFE 和 GDF15,也在 DBA 红细胞生成中上调(图 S7B)。此外,使用曲线下面积 (AUCell) 评分方法,发现在小鼠胎肝中上调的一组基因集也在 DBA 的EP 中富集,这是应激红细胞生成的原型(图 4B)。小鼠模型中应激性红细胞生成通常以牺牲其他谱系为代价,但在 RPL-DBA 中观察到髓祖细数量和功能的保留(图 S3D 和图 S4C),这与发现一致, 应激性红细胞marker仅存在于一部分单细胞中(图 4A 和图 S7B),不足挽救患者的 EP 功能或贫血。

为进一步探讨DBA疗法,目前外源性糖皮质激素仍然是 DBA 的唯一药物疗法,应激性红细胞生成需要内源依赖性糖皮质激素的转录程序,该程序以分化为代价促进 EP 扩增来增加红细胞输出。如体外数据(图 2K 和 L 以及图 S4F)所表明的那样,红细胞分化基因,如 GYPA、AHSP 和 HBB,与对照相比,在 RPL-DBA 中表达较高(图 2C 和 4C)。因为在糖皮质激素存在的情况下,HBB 和AHSP 的转录被糖皮质激素受体抑制,在RPL-DBA 分化模式中,反映了未能适当提高DBA 中内源依赖糖皮质激素应激性红细胞生成程序。与此一致,使用一组在小鼠 EP 中糖皮质激素上调的基因集给不同DBA类型患者打分,发现 在RPL-DBA 和 RPS-DBA的所有 DBA EP 亚群中糖皮质激素通路打分都显著低,在 RPL 突变的 EP 中降低得更为明显(图 4C)。ZFP36L2 是一种糖皮质激素反应基因,对糖皮质激素介导的分化延迟和随后增加小鼠胎肝中的红细胞至关重要,在原代 DBA 细胞中看到了表达显著降低(图 4E)。

为了研究降低ZFP36L2 的表达在红细胞生成受损中的作用,作者敲低了红细胞 K562 细胞中的 RPL11。与野生型相比,编辑的 RPL11 K562 细胞中的 ZFP36L2 表达降低(图 4F),这与在原代 DBA 骨髓细胞中的数据一致。接下来,如先前在鼠红细胞中发现的,用地塞米松处理 的RPL11 编辑组和K562 对照组的细胞相比,RPL1kd 组丢失了表达红细胞分化标志物 GYPA 和 CD71 的共表达(图 4G 到 I),随后与 ZFP36L2 表达的上调相称(图 4J)。来自 RPL5-DBA 患者的骨髓在皮质类固醇治疗前后的 RNA 测序(RNA-seq)也显示 ZFP36L2 增加,但 RPL5、ADA 和 HBG2 表达不变( 图 4K)。此外,将 ZFP36L2 互补 DNA (cDNA) 慢病毒转导到 RPL11 编辑的 K562 细胞中(图 S7E),它能弥补地塞米松诱导的 GYPA 表达丧失(图 S7、F 和 G),CD71GYPA与 CD71GYPA细胞在野生型和 RPL11 编辑的 K562 细胞中有更高的相对频率。(图 4,L 到 N)。

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Figure 4GHIJK

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制Figure 4 LMN

DBA 中 P53 通路被激活及骨髓炎症

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Figure 5ABCD

接下来,作者寻找 DBA 中失调的其他通路,发现 RPS-DBA 中血红素通路的负富集,而不是在 RPL-DBA EP 中的负富集,且两种基因型中都发现 p53 通路的激活(图 5A 和 B)。还确定了炎症通路的富集,包括肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 介导的信号传导、干扰素α (IFN-α) 介导的信号传导和 IFN-γ 介导的信号传导(图 5A),与已知的应激性红细胞生成。与 RPL-DBA 相比,RPS-DBA其富含炎症反应、IFN-α 反应和IFN-γ 反应,而不是 p53 和 TNF-α 通路(图 5B)。炎症和细胞因子介导的基因网络在整个 DBA HSPC中富集(图 S8、A 和 B),表明普遍的骨髓促炎状态与 RP 基因单倍剂量不足有关。与此一致,发现 DBA 中的 TNF-α 和 IFN-γ 浓度高于对照骨髓血浆(图 5C)。

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制Figure 5EFGHI

为了进一步验证 RPL-DBA 中异常的红细胞发育途径,对另外三名 RPL-DBA 患者和三名年龄匹配的健康人的进行bulk-seq(EB 是RPS-DBA 中几乎没有)。主成分分析(图 5D)显示对照和 DBA 样本的清晰划分,差异基因表达分析鉴定了 1709 个基因(图 5E)。与 RPL-DBA EP 中一样,基因集富集分析 (GSEA) 和途径分析揭示了 DBA EB 中 p53、TNF-α、IFN-α 和 IFN-γ 炎症途径的激活(图 5,F 和 G)。免疫蛋白酶体和抗原呈递途径,IFN-γ 通路也被富集,而核糖体生成发生减少(图 5F)。与对照 EB 相比,RPL-DBA 中糖皮质激素反应基因 ZFP36L2 的表达降低(图 5H),红细胞成熟标记物,例如 HBA1、HBA2 和 HBB,并且 HBG2 增加(图 5H)。因此,尽管 EB 可以在 RPL-DBA 中发展,但它们显示出在其上游祖细胞中识别出的相同病理通路的激活。最后,与正常相比,用作 DBA 诊断生物标志物的嘌呤代谢酶 eADA 在 RPL-DBA EB 中上调并高表达,与 RPL-DBA 患者血清红细胞腺苷脱氨酶 (eADA) 活性较高相匹配(图 5I)。

这些发现提供了人类原代 DBA HSPC 中促炎骨髓环境的证据。此外,尽管 RPL-DBA EP 在数量上相对保留,但在功能上,它们似乎对应于缺乏其标志性内源性糖皮质激素调节程序的应激性红细胞生成。这种异常的 EP 功能导致无序分化,进而减少 EP的维持。

在RPL-DBA中祖细胞和前体细胞保留了 GATA1 及其转录程序

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制Figure 6AB

作者有机会在不受类固醇治疗的影响下对 RPS-DBA 和 RPL-DBA 中的 GATA1在单细胞分辨率下的研究它的作用。首先,针对三个细胞亚群,分别用转录组数据进行了GATA1基因集的 GSEA。在 RPS-DBA EP(图 6A 和图 S9A)中鉴定到了耗竭的GATA1 转录特征,与严重的早期红细胞缺陷一致。相比之下,RPL-DBA EP 和 EB 在整个发育轨迹中都富含 GATA1 转录程序(图 6A 和图 S9A)。在 RPL-DBA LEP 和 EB 中,晚期而非早期的 GATA1 特征随着它们改变的分化轨迹而富集(图 S9A)。此外,与对照 EB 相比,RPL-DBA 中 GATA1 short 和 GATA1 full-length 亚型的表达没有变化(图 6B)。这表明由 RPL 单倍体不足引起的 DBA 不太可能由不平衡的 GATA1 异构体丰度支持,就像 DBA 样疾病患者的情况一样,系 系GATA1 突变保留了 GATA1 short。

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制Figure 6CDEF

为了阐明 RPS 或 RPL 单倍体不足对原代 DBA 骨髓细胞中 GATA1 蛋白表达的影响,又对七名 RPL5/11-DBA 患者、四名 RPS19/24/26-DBA 患者和三名健康对照者的骨髓切片进行染色 ,使用专用于 GATA1 全长的抗体(图 6,C 到 E,和图 S9,B 到 D)。在 RPS-DBA 中,大多数 GATA1+ 细胞对红细胞标记物糖蛋白 C(GYPC)呈阴性,并且在形态上对应于非红细胞前体(图 6C)。总体而言,与对照红细胞相比,RPL-DBA 中的 GATA1 表达高于 RPS-DBA EB,而 RPL-DBA 中的 GATA1 表达仅略低(图 6E)。结合细胞表面和细胞内染色,随后进行流式细胞术(图 6F)或 CyTOF(图 S9E)显示 RPL5-DBA 和对照原代 EP 和 EB 中 GATA1 表达的相似模式。总之,这些发现表明,在保存的 EP 和 RPL-DBA 的前体中,GATA1 表达及其转录程序在很大程度上是完整的。

RPL-DBA 的独特临床表型

单细胞揭示DBA患者红系谱系衰竭的机制Figure 7ABCD

因为作者的数据表明 RPL-DBA 中的细胞和功能缺陷比体外 RPS-DBA 更轻微,接下来通过分析英国 DBA 的特征和记录的 RPL (n = 44) 和 RPS (n = 62) 突变。与转录组学和功能数据一致,与 RPS-DBA 患者相比,RPL-DBA 患者出现贫血的年龄(无论性别)和血红蛋白浓度更高(图 7,A 和 B;图 7),S10,A 到 C;数据文件 S5)。此外,较高比例的 RPL-DBA 患者最初对皮质类固醇有反应(图 7C、图 S10D 和数据文件 S5),尽管长期的类固醇依赖(图 7D 和图 S10E)和自发比率没有增加或类固醇诱导的缓解在基因型之间没有差异(图 S10F)。还证实了之前的观察结果,与 RPL-DBA 相比,RPL-DBA 中更高的 indel 遗传变异(图 S10G)和先天性异常(图 S10H),以及 RPL5 与腭裂, RPL11和先天性拇指异常之间的关联(图 7D 和图 S10I。总之,这些基因型-表型相关性验证了转录组学和功能研究,确定不同红细胞发育途径的临床和生物学相关性(图 S11)。

亮点

  • 根据基因型,描述了同一种病下二种不同突变类型的病理特征和分子机制
  • 提供了DBA候选治疗靶点ZFP36L2
  • 紧密联系临床,说明两种DBA突变亚型与临床表型、治疗反应之间的关系

局限性

  • 仅限于HSPC和红细胞前提的研究,不包括成熟的髓系和免疫等细胞
  • RP基因单倍体不足导致糖皮质导致糖皮质激素反应通路受损的确切机制有待研究
  • 需要对DBA具有不同基因型(RPS-DBA、RPL-DBA或其它)的大量患者进行调查,以进一步完善基因型-表型相关性

版权声明:Robin 发表于 2022年6月13日 上午12:24。
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