「解读」CRISPR研究思路

2019年获资助的CRISPR相关项目共72个,总资助金额高达3485万元,近十年CRISPR的资助项目走势图如下,从2010年开始一路上扬,在2017年达到近几年的资助峰值4000万,虽说这两年有呈现下降趋势,但今年依旧狂揽近3500万,你确定不了解一下?

「解读」CRISPR研究思路

「解读」CRISPR研究思路

虽然基因编辑的技术很多,例如基因定位,表观遗传修饰,单碱基基因编辑系统(BE2,BE3,ABE等)、CRISPR/C2c2基因突变检测系统等等。但CRISPR/Cas9系统最简单实用,应用更加便捷广泛,目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌等基因组精确修饰,成为科研人员的强大工具,基于CRISPR临床实验已经取得初步成功,预计未来几年还会很火,以Nature Cell Biology(IF:20.04)期刊上文章“LncGata6 maintains stemness of intestinal stem cells and promotes intestinal tumorigenesis”为例,阐述一种CRISPR研究思路,值得学习借鉴。

1.转录组测序筛选差异基因,并利用CRISPR技术敲低上调LncRNAs进行验证

从鼠小肠上皮细胞分选获得Lgr5+细胞,进行转录组测序,筛选差异表达lncRNAs,得到差异lncRNAs。通过CRISPR技术分别敲低上调表达前10的lncRNAs进一步筛选,发现lncGata6下调表达对肠道干细胞(intestinal stem cells, ISCs)形成类器的影响最显著,并通过qPCR验证得到lncGata6在成熟ISCs细胞高表达。

「解读」CRISPR研究思路

2.对lncGata6表达进行定位研究及验证

通过建立老鼠模型对lncGata6基因表达进行定位研究,发现其主要分布在肠道组织中,接着通过荧光原位杂交等实验验证了lncGata6在小鼠和人的ISCs中高表达。

「解读」CRISPR研究思路

3. 利用CRISPR/Cas9技术敲除lncGata6进行验证,发现导致ISCs细胞损伤进而影响肠道组织再生功能

「解读」CRISPR研究思路

4. 寻找与lncGata6相关的基因表达形成以上3现象中的作用机制

首先找lncGata6调控的靶蛋白,敲除lncGata6,看其邻近相关基因的表达水是否受到影响,最终确定调控方式是远程调控,最后通过一系列实验表明lncGata6的作用与Bptf的相互作用有关以及lncGata6可以激活Ehf启动子表达。

「解读」CRISPR研究思路

「解读」CRISPR研究思路

5. 顺藤摸瓜,顺着Ehf继续找寻作用机制

发现lncGata6可以激活Ehf启动子表达后,进一步研究下游Ehf调控ISCs功能作用机制,通过之前相似的步骤,建立老鼠模型,转录组分析,CRISPR/Cas9基因敲除等实验,最终发现激活ISCs细胞的Wnt信号通路,从而调控ISCs细胞的干性维持。

「解读」CRISPR研究思路

6. 接下来是文章升华部分,进一步验证lncGATA6是否与肠道肿瘤发生

有关,发现lncGata6可以通过wnt信号通路促进肿瘤发生,说明lncGaTa6可能是治疗结肠癌潜在的作用靶点。

「解读」CRISPR研究思路

整篇文章的思路如下:

「解读」CRISPR研究思路

版权声明:Robin 发表于 2022年3月7日 pm7:21。
转载请注明:「解读」CRISPR研究思路 | 爱学术导航

相关文章

暂无评论

暂无评论...