你值得拥有的线粒体circRNA研究思路

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本文通过靶向线粒体纳米颗粒技术将目标circRNA特异性递送到线粒体揭示了circRNA SCAR通过降低线粒体ROS(mROS)的外转减轻NASH的分子机制。

研究背景

非酒精性脂肪肝炎(NASH)大家应该都比较熟悉,是一种免疫代谢疾病,严重的会发展为肝硬化,主要是由非酒精性脂肪肝(NAFLD)发展而来,与胰岛素抵抗和高血脂密切相关。线粒体是细胞的重要器官,而mROS能够激活免疫细胞,引起炎症反应。本文的关注点在于线粒体中的非编码RNA(circRNA)如何调控肝脏成纤维细胞中的mROS,从而影响细胞因子释放。

研究方法

既然能发Cell,肯定是有几个比较突出的研究技术的,比如:

(1)递送circRNA至线粒体内的纳米颗粒技术

(2)APEX标记实验:主要确定circRNA、结合蛋白是否在同一线粒体区隔内;

(3)CLIP seq:主要为了检测circRNA与hnRBP的结合位点;

还有一些比较常用的研究方法,比如:

RNA-pull down、RIP、FISH、ChIP等。

细胞选用的是NASH肝纤维化患者的肝成纤维细胞。

研究内容

1.体外细胞实验:

(1)mROS促进脂暴露成纤维细胞的炎症表型

首先检测了NASH成纤维细胞中的糖酵解和氧化磷酸化情况,发现NASH和脂暴露的成纤维细胞中线粒体活动从氧化磷酸化转向糖酵解,表明线粒体承受压力,此时NASH中线粒体ROS(mROS)和细胞ROS(cROS)含量均显著升高。通过ROS抑制剂和炎性因子检测证明ROS促进成纤维细胞炎性因子分泌。

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(2)脂暴露诱导成纤维细胞中线粒体circRNA的不平衡

作者主要想研究的对象是circRNA,所以就对NASH患者和健康的成纤维细胞进行测序,发现许多circRNA都显著低表达。其中有四个线粒体circRNA,RT-qPCR验证其表达量。

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然后就是非常厉害的纳米颗粒技术,在体外用纳米材料将circRNA包裹,进入细胞后circRNA将在线粒体被释放。感兴趣的小伙伴可以阅读原文找到具体的方法。将circRNA SCAR导入线粒体后,cROS含量降低。

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(3)circRNA SCAR定位于线粒体并抑制成纤维细胞活化

FISH和RT-qPCR检测成纤维细胞中的circRNA SCAR,发现circRNA SCAR主要在线粒体中表达。相比正常细胞,NASH成纤维细胞中表达量显著降低。用脂暴露成纤维细胞验证,获得相同结果。

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2. 分子机制研究:

(1)circRNA SCAR直接结合ATP5B

用RNA-pull down的方法筛选circRNA SCAR的结合蛋白,进一步用RIP、WB、体外RNA/蛋白结合实验确定与SCAR互作的mPTP的调控蛋白ATP5B。APEX标记实验确定两者的共定位。

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将两者结合位点突变,SCAR与ATP5B不结合,且NASH中ROS的抑制效果消失。

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(2)circRNA SCAR干预CypD和mPTP互作从而关闭mPTP通道

为了探究circRNA通过何种机制调控mPTP通道,作者进行了钙黄绿素释放实验。过表达SCAR降低mPTP的转运,功能回复实验表明,突变SCAR和ATP5B结合位点恢复mPTP的转运效率,而敲减mPTP通道适配蛋白CypD恢复SCAR过表达表型。

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(3)脂诱导的内质网压力通过CHOP抑制PGC-1a介导的circRNA SCAR表达

为了寻找SCAR上游的调控因子,作者敲减hnRNP蛋白并检测SCAR表达量,发现hnRNPM与SCAR相关。生信分析发现SCAR启动子上有PGC-1α的结合域,ChIP验证两者的结合。敲减PGC-1α,circRNA SCAR表达量显著降低。进一步敲减PGC-1α的调控蛋白CHOP,发现脂暴露下circRNA SCAR表达恢复。

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3. 动物模型实验:

小鼠中circRNA SCAR减轻高脂饮食诱导的肝硬化

为了在动物模型中验证circRNA SCAR对NASH的影响,作者给高脂饮食小鼠注射纳米颗粒包裹的circRNA SCAR。免疫组化显示注射SCAR的小鼠肝脏免疫细胞浸润显著减少。

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4. 临床相关性验证:

circRNA SCAR与脂肪肝-NASH进程相关(临床)

最后,作者检测了NASH和肝硬化患者肝脏中circRNA SCAR的表达,发现其与cROS含量和肝硬化程度负相关。

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根据以上结果最终提出假说图:

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总 结

本文的工作量不算大(相对其他Cell的文章来说)但能够发在Cell上的原因有几点:

1.创新型较强:circRNA的研究有很多,但对于线粒体circRNA的研究却比较少见,原因可能也是这方面的实验比较难做。但作者克服了重重困难,获得了较好的结果,揭示了整个分子信号通路,实属不易。

2.选择了合适的实验技术:本文比较关键的技术就是纳米颗粒定向运送circRNA。这个技术的运用很好地解决了线粒体内分子研究的问题,相应地举一反三基本适合其他线粒体的非编码RNA研究。

3.研究思路完整,临床意义大:本文为了使自己的故事更为完整(发Cell),以circRNA为原点,将分子机制扩散至上下游,从转录到调控,中间经历了5个蛋白,可以说机制是很完整了。并且由于拥有纳米颗粒技术,这个研究的临床意义也就显而易见。

虽然我们平时的研究由于天时地利人和等条件限制,可能做不到本文这样,但也可以学习其中的一两点,照样能做出不错的研究。

版权声明:Robin 发表于 2022年3月7日 pm7:21。
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