你值得拥有的线粒体circRNA研究思路

既然能发Cell，肯定是有几个比较突出的研究技术的，比如：

（1）递送circRNA至线粒体内的纳米颗粒技术；

（2）APEX标记实验：主要确定circRNA、结合蛋白是否在同一线粒体区隔内；

（3）CLIP seq：主要为了检测circRNA与hnRBP的结合位点；

还有一些比较常用的研究方法，比如：

RNA-pull down、RIP、FISH、ChIP等。

细胞选用的是NASH肝纤维化患者的肝成纤维细胞。

1.体外细胞实验：

（1）mROS促进脂暴露成纤维细胞的炎症表型

首先检测了NASH成纤维细胞中的糖酵解和氧化磷酸化情况，发现NASH和脂暴露的成纤维细胞中线粒体活动从氧化磷酸化转向糖酵解，表明线粒体承受压力，此时NASH中线粒体ROS（mROS）和细胞ROS（cROS）含量均显著升高。通过ROS抑制剂和炎性因子检测证明ROS促进成纤维细胞炎性因子分泌。

（2）脂暴露诱导成纤维细胞中线粒体circRNA的不平衡

作者主要想研究的对象是circRNA，所以就对NASH患者和健康的成纤维细胞进行测序，发现许多circRNA都显著低表达。其中有四个线粒体circRNA，RT-qPCR验证其表达量。

然后就是非常厉害的纳米颗粒技术，在体外用纳米材料将circRNA包裹，进入细胞后circRNA将在线粒体被释放。感兴趣的小伙伴可以阅读原文找到具体的方法。将circRNA SCAR导入线粒体后，cROS含量降低。

（3）circRNA SCAR定位于线粒体并抑制成纤维细胞活化

FISH和RT-qPCR检测成纤维细胞中的circRNA SCAR，发现circRNA SCAR主要在线粒体中表达。相比正常细胞，NASH成纤维细胞中表达量显著降低。用脂暴露成纤维细胞验证，获得相同结果。

2. 分子机制研究：

（1）circRNA SCAR直接结合ATP5B

用RNA-pull down的方法筛选circRNA SCAR的结合蛋白，进一步用RIP、WB、体外RNA/蛋白结合实验确定与SCAR互作的mPTP的调控蛋白ATP5B。APEX标记实验确定两者的共定位。

将两者结合位点突变，SCAR与ATP5B不结合，且NASH中ROS的抑制效果消失。

（2）circRNA SCAR干预CypD和mPTP互作从而关闭mPTP通道

为了探究circRNA通过何种机制调控mPTP通道，作者进行了钙黄绿素释放实验。过表达SCAR降低mPTP的转运，功能回复实验表明，突变SCAR和ATP5B结合位点恢复mPTP的转运效率，而敲减mPTP通道适配蛋白CypD恢复SCAR过表达表型。

（3）脂诱导的内质网压力通过CHOP抑制PGC-1a介导的circRNA SCAR表达

为了寻找SCAR上游的调控因子，作者敲减hnRNP蛋白并检测SCAR表达量，发现hnRNPM与SCAR相关。生信分析发现SCAR启动子上有PGC-1α的结合域，ChIP验证两者的结合。敲减PGC-1α，circRNA SCAR表达量显著降低。进一步敲减PGC-1α的调控蛋白CHOP，发现脂暴露下circRNA SCAR表达恢复。

3. 动物模型实验：

小鼠中circRNA SCAR减轻高脂饮食诱导的肝硬化

为了在动物模型中验证circRNA SCAR对NASH的影响，作者给高脂饮食小鼠注射纳米颗粒包裹的circRNA SCAR。免疫组化显示注射SCAR的小鼠肝脏免疫细胞浸润显著减少。

4. 临床相关性验证：

circRNA SCAR与脂肪肝-NASH进程相关（临床）

最后，作者检测了NASH和肝硬化患者肝脏中circRNA SCAR的表达，发现其与cROS含量和肝硬化程度负相关。

根据以上结果最终提出假说图：

本文的工作量不算大（相对其他Cell的文章来说）但能够发在Cell上的原因有几点：

1.创新型较强：circRNA的研究有很多，但对于线粒体circRNA的研究却比较少见，原因可能也是这方面的实验比较难做。但作者克服了重重困难，获得了较好的结果，揭示了整个分子信号通路，实属不易。

2.选择了合适的实验技术：本文比较关键的技术就是纳米颗粒定向运送circRNA。这个技术的运用很好地解决了线粒体内分子研究的问题，相应地举一反三基本适合其他线粒体的非编码RNA研究。

3.研究思路完整，临床意义大：本文为了使自己的故事更为完整（发Cell），以circRNA为原点，将分子机制扩散至上下游，从转录到调控，中间经历了5个蛋白，可以说机制是很完整了。并且由于拥有纳米颗粒技术，这个研究的临床意义也就显而易见。

虽然我们平时的研究由于天时地利人和等条件限制，可能做不到本文这样，但也可以学习其中的一两点，照样能做出不错的研究。