国自然15分文章解析m6A和miRNA热点

在肿瘤中基因表达可以通过多种过程控制,包括转录,mRNA降解,翻译和蛋白质降解等。尽管对基因翻译和蛋白质降解进行了广泛研究,但现在国自然越来越多的项目是通过研究探索非编码RNA(如microRNA(miRNA),LncRNA)和新的mRNA修饰(包括N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰)的作用来关注mRNA的翻译。

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作为mRNA中含量最丰富的修饰之一,m6A修饰通常通过将eIF3等启动因子招募到mRNA的5‘端来促进翻译,对许多生物学过程起到非常重要的作用,也因此越来越成为近年来国自然申请的热点课题。今天小编就带来一篇包含了m6A,miRNA研究热点的文章,主要讲了β-catenin通过抑制miRNA促进下游的m6A修饰并促进其翻译的工作。这篇文章也受到了省自然和国自然的资助,并且发表在了Molecular Cancer(15.3)上。

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1.β-catenin调节结直肠癌热休克蛋白1

作者通过之前的研究发现在结直肠癌中Wnt/β-catenin信号相关的表达与HSF1呈正相关,表明HSF1与Wnt/β-catenin信号有潜在的联系,随后作者用荧光素酶报告实验验证,并且发现HSF1已知下游基因表达减少,染色质免疫沉淀(CHIP)试验进一步证这一结果。同时敲降β-catenin也降低了HSF1的活性,并减少了HSF1靶基因的表达。另一方面在结肠癌细胞系RKO中GSK3β抑制剂上调了HSF1的靶点并降低β-catenin表达,同时作者又利用抑制剂处理的野生型及敲除HSF1的成纤维细胞做RNA-seq分析发现许多基因可能为HSF1的靶点且不能被抑制剂处理而上调。

结论:β-catenin对HSF1具有正向调节作用。

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2.β-catenin刺激HSF1蛋白翻译

随后作者抑制了β-catenin发现降低了HSF1的蛋白水平,过表β-catenin结果相反。此外,在RKO和MEF细胞中激活Wnt/β-catenin信号后,HSF1蛋白水平增加,同时发现HSF1的表达与β-catenin在组织中的表达有显著相关性。所以β-catenin可上调HSF1蛋白的表达。然而,在β-catenin基因敲除后,HSF1mRNA水平没有明显改变,并且HSF1蛋白的半衰期也没有改变,蛋白酶体、自噬和钙蛋白酶的抑制剂都不能逆转由β-catenin基因敲除引起的HSF1蛋白下调。所以作者猜想β-catenin是通过翻译调控影响了hsf-1蛋白水平。作者使用嘌呤霉素标记实验发现β-catenin的耗尽减少了HSF1的嘌呤霉素标记。并且对胞质提取物进行RT-RCR发现增加了非翻译核糖体中HSF1mRNA的存在。

结论:β连环蛋白促进HSF1的表达而不影响其mRNA水平。

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3.HSF1蛋白翻译受miR455-3p调控

作者通过TargetScan、miRDB和Starbase生物信息学筛选,经过WB验证,最终选定miR455-3p。miR455-3p的抑制剂挽救了β-catenin敲除后的表型,荧光素酶实验,生物素下拉实验进一步证实了miR455-3p与HSF1mRNA的相互作用。TCGA数据库及qPCR分析显示结直肠癌组织中miR455-3p的水平低于癌旁。作者随后发现miR455-3p的表达与HSF1的表达呈负相关,并且减少了HSF1靶基因表达,诱导了结直肠癌细胞的活性抑制和凋亡激活

结论:miR455-3p靶向HSF1mRNA抑制其翻译。

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4.M6A修饰HSF1 mRNA刺激其蛋白翻译

作者在机制方面首先发现了HSF1的3‘-UTR有一个典型的m6A修饰基序。随后进行了MERIP测序确认其m6A修饰位点,MERIP后的PCR分析进一步验证。同时突变体HSF1的3‘-UTR不能结合miR455-3P,但保留m6A修饰位点序列。甲基转移酶METTL3和m6A阅读器蛋白YTHDF1表达量调控m6A水平,m6A修饰的下降HSF1的表达也下降。

结论:HSF1mRNA的m6A修饰可能与促进其翻译有关。

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5.β-catenin抑制miR455-3p增加HSF1mRNA m6A修饰

之后作者研究了miR455-3p与HSF1的m6A修饰之间的相互作用。当miR455-3p过表达时,m6A水平及其与METTL3的结合降低。同时发现METTL3的减少不仅降低了HSF1的m6A水平,而且增强了miR455-3p与HSF1的相互作用。另一方面miR455-3p抑制剂挽救了β-catenin耗竭引起的HSF1m6A修饰的减少,同时增加了miR455-3p与HSF1的互作。相反,当β-catenin被过表达或抑制剂处理上调时miR455-3p被下调。作者发现miR455-3p来自基因COL27A1的内含子并且表达与miR455-3p一致,不论是mRNA水平还是蛋白水平β-catenin与COL2 7A1均呈负相关。所以Wnt/β-catenin信号抑制了COL27A1的转录,导致miR455-3p的减少。

结论:β-catenin通过抑制miR455-3p的表达,促进HSF1mRNA的m6A修饰,最终促进HSF1蛋白的翻译。

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6.基因和化学抑制HSF1对小鼠结直肠癌的抑制作用

最后作者利用Apcmin/+(结直肠癌小鼠病变前模型)和Apcmin/+HSF1+/−小鼠来进行大肠癌发生的动物实验。与正常小鼠相比,Apcmin/+小鼠肠道组织中HSF1及其下游靶GLS1的表达增加,而miR455-3p的表达降低。在高脂喂养3个月后,这些Apcmin/+小鼠出现了肠道多发性肿瘤。然而,用HSF1的化学抑制剂KNK437和在Apcmin/+鼠中减少HSF1表达处理的Apcmin/+小鼠的肿瘤大小和数量都显著减少,同时HSF1靶基因下调。

结论:HSF1是Wnt/β-catenin信号的一个新的下游靶点,对促进结直肠癌的发展具有重要意义。

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研究思路

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版权声明:Robin 发表于 2022年3月7日 pm7:20。
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