J. Am. Chem. Soc. | 光保护泛素探针鉴定去泛素化酶

大家好,今天为大家推荐一篇来自于JACS上的文章,文章的通讯作者是来自特拉华大学的Zhihao Zhuang,他的课题组主要关注细胞内的泛素化修饰。

J. Am. Chem. Soc. | 光保护泛素探针鉴定去泛素化酶

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泛素化修饰是细胞内非常重要的一种可逆化的翻译后修饰。泛素蛋白是一个含有76个氨基酸的蛋白,主要修饰在底物的赖氨酸上。细胞内存在大量的去泛素化酶(DUB),这些酶可以特异性的去除蛋白底物上泛素修饰。目前有很多基于活性的鉴定DUB蛋白的探针,但是这些探针大多数只能在细胞裂解液中鉴定DUB。本篇文章希望能够开发一个在活细胞体系内鉴定DUB的探针。并且为了能够实时的检测细胞活动,本篇文章还引入了一个光保护集团,可以实现时空特异性的调控。

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四唑可以在光照的条件下释放一分子氮气并形成腈基胺的结构,这一结构可以与周围的亲核试剂发生反应。于是文章在之前他们开发的可代谢泛素探针的c端连接上了一个四唑基团。而在探针的N端则连接着一个HA标签和一个二硫键基团,并将其命名为HA-Cys(CR10)-Ub-TZ, 同时他们还合成了暴露巯基的HA-Cys-Ub-TZ作为分子模型上使用的对照探针。

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在得到了探针之后他们首先测试了探针是否可以被光激活,在使用365nm UV照射15min后,他们能够在质谱上得到清晰的脱保护产物信号,并且在加入纯蛋白USP2后,能明显看到探针与USP2的结合。但是如果加入的是活性半胱氨酸突变的USP2的话则能明显观察到产物信号的大幅度减少。此外他们还在c端去泛素化酶UCHL3和UCHL1上测试了探针的标记能力。结果显示均能很好的实现标记效果。最后他们分别在细胞裂解液和活细胞内进行了测试,他们发现探针都可以标价到DUB蛋白。

在测试了探针的标记效果后,文章利用这一探针进行了DUB组学上的鉴定。利用HA tag进行富集,他们鉴定到了15个已知的DUB,并且有一些蛋白酶相关的蛋白也被鉴定到,这可能是蛋白间相互作用的结果。在优化好整个的组学流程后,文章利用这一探针实现了特异性鉴定细胞G1/S和G2/M期的DUB蛋白组。对比两个时期富集下来的DUB蛋白,G1期有5个特异性富集的DUB,而G2期则有1个。其中BAP1和USP36在之前的研究中就被证实与G1期的泛素化调控密切相关。在对G2期的研究中也发现倍富集的USP16蛋白具有调控蛋白定位的功能。文章还进行了一个时间梯度的鉴定试验,他们发现DUB在分裂过程中的功能是随时间变化的,他们发现USP16在分裂早期可以被富集,但4h后富集效果就不够明显了。

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总而言之,本篇文章开发了一个可以在活细胞内实现时空特异性的鉴定DUB蛋白的活性探针,并实现了对细胞分裂过程中不同时期的DUB蛋白的组学鉴定了,证明了DUB在分裂过程中的作用是动态的。

本文作者:LZH

原文链接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b12426

原文引用:DOI:10.1021/jacs.9b12426

版权声明:Robin 发表于 2022年3月7日 pm7:19。
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