容易模仿的5-10分的CRISPR筛选范文解析

这次给大家推一篇比较好学,又比较偏基础医学的CRISPR筛选研究。这篇去年11月发表于eLIFEIF=7.08,虽然影响因子有下滑态势,但这个期刊有点来头,文章质量也过硬)的文章,通过CRISPR/Cas9筛库技术揭示了非小细胞肺癌(NSCLC)靶向药物耐药性产生的机制。文章从筛选到表型验证做得比较完整,在肿瘤领域可以作为5-10分的CRISPR筛选范文来借鉴。

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原文链接:https://elifesciences.org/articles/50223

研究背景


非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌中非常常见的一种,其中EGFR基因突变是导致NSCLC的病因之一。针对EGFR突变的治疗靶向药物——TKI抑制剂在近几年已经得到广泛的使用,并获得了不错的疗效。然而,耐药性成为了靶向药物治疗癌症的一大障碍。NSCLC肿瘤细胞产生耐药性的原因很多,大体上可以总结为EGFR的下游通路基因被另一种方式激活。然而很多情况下患者产生的耐药性包含多个机制,这些机制的具体原因不明,因此难以开发有针对性的治疗策略。本文通过CRISPR/Cas9筛选耐药肿瘤细胞中除EGFR以外的差异基因和通路,由此作为应对耐药性治疗的理论依据。


研究内容


1.全基因组CRISPR/Cas9筛选EGFR突变的NSCLC中调控EGFR TKI(靶向药物)敏感性的基因

首先作者使用了EGFR突变的NSCLC细胞系HCC827,并将其分为药物敏感和药物抵抗细胞进行CRISPR筛选。筛选得到的基因通过STRING进行网络分析,得到若干基因富集通路。

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2.调控EGFR TKI敏感性候选基因的验证

分别设计上述筛选到的候选基因的sgRNA,重新构建CRISPR/Cas9基因敲除的HCC827细胞并进行细胞克隆实验验证药物敏感性,进一步缩小目标基因范围。

可以看到,RIC8A、YAP1、PKN2、GNB2(敲除后对药物敏感)和ARIH2CUL5RNF7BTAF1(敲除后对药物耐受)都是有非常明显表型的基因。

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3.EGFR突变的RIC8A敲除NSCLC细胞中使用EGFR抑制剂导致细胞合成致死

在这些候选基因中,作者把关注点放在了比较著名的RIC8A上。在不同形式的EGFR突变细胞中敲除RIC8A,都表现出HCC827细胞对药物的敏感性,在使用药物后RIC8A敲除细胞生长被显著抑制,EGFR下游通路基因表达显著降低。

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4.敲除RIC8A减弱EGFR突变的NSCLC细胞中YAP通路介导的肿瘤细胞增殖

做完RIC8A的功能验证,就要做具体的分子机制。已有文献报道YAPRIC8A的下游通路之一,因此作者通过检测RIC8A敲除细胞中YAP下游调控基因的表达量,以及YAP功能回复实验验证RIC8A通过YAP调控肿瘤细胞增殖这一机制。通过对以往研究的调查作者推测RIC8A可能通过Gα-Rho/Rac信号轴影响YAP,简单验证一下,RIC8A/Gα/RHOA/YAP这条信号轴算是连通了。(这里的机制研究确实做得浅了些)

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5.体内外实验验证ARIH2缺失导致EGFR TKI耐药性

验证完对药物抵抗有正向作用的基因,作者又将目标转向抑制耐药性的基因ARIH2。实验方法和之前类似,但这里作者还增加了小鼠移植瘤实验观察体内情况。结果证明,敲除ARIH2对细胞活力没有影响,但是细胞的耐药性增加,表现为使用药物后细胞增殖显著高于对照组。

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6. ARIH2通过调控METAP2表达量影响肿瘤细胞耐药性

为了找到ARIH2调控细胞耐药性的分子机制,作者对ARIH2敲除细胞做了蛋白组分析。结果发现了三个显著高表达的蛋白METAP2ALDOAPSAT1。在肿瘤细胞中过表达METAP2,肿瘤细胞耐药性增强,而敲除ARIH2后细胞中METAP2的蛋白含量增加。同样过表达ALDOAPSAT1,肿瘤细胞耐药性增强。然而,作者并没有找到ARIH2调控METAP2的直接分子机制。

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总结


这篇文章在机制上研究不够深入,只是根据以往研究推测和验证了一下筛库所得的基因对EGFR突变细胞耐药性的影响。然而,对于一篇CRISPR筛选的文章来说,从筛库到体内外验证,整个过程还比较完整,临床意义也比较充分。如果大家对于分子机制的研究不擅长,倒是可以考虑学习一下这篇文章的方法,从工作量到难易程度都比较适中,适合想要做影响因子5-10文章的小伙伴参考。

最后,还是放上CRISPR/Cas9文库筛选流程方便大家理解。

容易模仿的5-10分的CRISPR筛选范文解析

版权声明:Robin 发表于 2022年3月7日 下午7:19。
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