打孔引起的离奇死亡,来看Science上的细胞焦亡研究

今天要跟大家分享的是近期热点:细胞焦亡接下来咱们一起看看20204月发表在《Science》的这篇题为Granzyme A from cytotoxic lymphocytes cleaves GSDMB to trigger pyroptosis in target cells的文章吧。

打孔引起的离奇死亡,来看Science上的细胞焦亡研究

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研究背景

1、细胞焦亡

细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死,是一种程序性细胞死亡,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应,在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是由gasdermin介导的细胞程序性坏死。依赖于caspase 1,从根本上将细胞焦亡与其它细胞死亡途径区分开来。

细胞凋亡的特征有:

细胞膜破裂;DNA降解;产生炎症体;活化的IL-1βIL-18的释放。

2.细胞毒性淋巴细胞

细胞毒性淋巴细胞是一类主要的免疫效应细胞,主要包含细胞毒性T细胞(CTLs)或自然杀伤细胞(NK cells),杀伤的机制主要有两种:FAS/FASL通路和Perforin/Granzymes通路,普遍认为后者是主要杀伤机制。


结果结构

1.作者前期文章证明了细胞焦亡相关的主要蛋白家族Gasdermin,但是这个蛋白家族是否在CTLsNKcells杀伤靶细胞过程中发挥作用还从来没有人阐明。于是作者构建了含有肿瘤细胞(293T)和NK细胞的共培养杀伤体系。通过WB和荧光染色技术发现当过表达GSDBM蛋白时,杀伤实验中靶细胞的焦亡增多。作者进一步使用caspase抑制剂,发现这个过程不依赖于caspase途径。而使用NK细胞颗粒酶释放抑制剂,抑制了Granzyme蛋白,发现细胞焦亡明显减少。

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Fig 1 GSDMB与细胞焦亡的相关性


2.紧接着作者开始研究GSDMBGranzyme的关系,作者构建了五种人类Granzymes进行实验,发现Granzyme AGZMA)可以高效切割GSDMB蛋白,产生30KD16KD片段。作者为了找到具体的作用位点,使用Edman测序证明第244位和229位的赖氨酸(Lysine)是切割位点。并通过点突变证明Lys244是最主要的切割位点。通过形态和LDH释放的方法说明切割GSDMB后细胞才发生焦亡。以上数据论证了GZMA切割GSDMB是细胞焦亡的充分必要条件。

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Fig 2 GASMB可以特异切割条带

3.前面发现了切割的现象,那么它的作用是什么呢?作者利用电转法表达了有活性的GZMA蛋白。作者通过电转的方法将活性GZMA蛋白转入细胞内部,导致GSDMB阳性细胞发生剧烈焦亡,当敲除GSDMB基因后,则不发生焦亡。接着,作者在NK细胞杀伤体系和CTLs细胞杀伤体系中敲低GZMA,证明其在细胞毒性发挥过程的作用。而且IFN-αIFN-βIFN-γTNF-α能上调GSDMB的表达,尤其是IFN-γ,可以增加上述体系对靶细胞的杀伤力。

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Fig3验证GZMA在其他细胞中的作用

4.GZMA-GSDMB的机制在体内水平是否发挥作用呢?于是作者设计了一系列实验。首先作者构建酶活位点突变体细胞,与anti CD19 CAR-T cell共培养,仅在CAR T细胞表达GSDM时,才会引起293T细胞的焦亡,导致钙黄绿素泄露。相反,沉默CAR T细胞的GZMA表达,可以逆转这个过程。而且在人的原代T细胞中GSDMB也有切割现象。进一步左右在小鼠中构建GZMA同源序列(mGZMA),可以在小鼠脾脏CTL中发现GSDMB依赖的焦亡。

上述实验在小鼠体内构建了一套适用的切割体系,并成功验证GSDMB介导的焦亡。

而且作者在小鼠结肠癌细胞系CT26细胞中过表达了野生型GSDMB还有突变型GSDMB,发现野生型GSDMB可以增加anti PD-1的疗效,表现为移植瘤体积减小。

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Fig 4切割导致的细胞焦亡途径在体外的细胞杀伤途径中也存在

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Fig 5GZMA裂解GSDMB促进小鼠肿瘤的清除


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文章概念图


主要方法

1、表征焦亡:

1)光学显微镜:细胞质特征性膨胀透亮改变;

2)Calcein-AM染色和碘化丙啶(PI):分别对活细胞和死细胞染色。

3)lactate dehydrogenase (LDH)释放检测

2、细胞共培养:

1)人源细胞:NK细胞(NK-92MIvsYTS),T细胞(anti-CD19 CAR T cellNY-ESO-1–specific TCR T cells),肿瘤细胞(293T ,HeLa, A375, SW480,SW837, OE19, SKCO1,HCC1954

2)鼠源细胞:(表达人源GSDMB,被鼠源GZMA杀伤)

CT26小鼠结肠癌细胞(PDL1抗体敏感),MC38,MouseCTL (OT-1)

3、检测切割Edmansequencing蛋白测序


总结

作者对原来公认的perforin细胞焦亡途径进行了补充,首先发现GSDMB影响细胞焦亡的表型,紧接着证明了GZMAGSDMB的切割作用,随后对这种切割作用的体内体外功能进行了阐述,最后使用antiPD1药物进行动物实验,进一步证明了这个机制的治疗转化意义。思路十分清晰,先发现表型,再验证功能,最后应用目前临床应用的药物。

文章的创新点在于,从生化细胞细胞间交互,层层深入论证。以前人们通常认为是perforin打孔,现在多了一条路,GSDMB-N也可以打孔,补充了新的细胞焦亡概念。启发:简单的逻辑,新颖的故事,作者在前期基础上找到了一个新的切割机制。虽然我们暂时不能像大牛一样拓宽领域的认知,但是我们多读文献,像大牛一样多质疑,多argue,有自己的想法,多提出自己的问题。

比如笔者:凋亡和焦亡过程是否有交叉?没有GSDMB的时候发生凋亡,有GSDMB的时候有焦亡,这两种细胞程序性死亡过程是否存在时间上的关系?希望小伙伴们可以一起思考讨论。

版权声明:Robin 发表于 2022年3月7日 pm7:18。
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