今天要跟大家分享的是近期热点：细胞焦亡。接下来咱们一起看看2020年4月发表在《Science》的这篇题为“Granzyme A from cytotoxic lymphocytes cleaves GSDMB to trigger pyroptosis in target cells”的文章吧。
1、细胞焦亡
细胞焦亡（Pyroptosis）又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是由gasdermin介导的细胞程序性坏死。依赖于caspase 1，从根本上将细胞焦亡与其它细胞死亡途径区分开来。
细胞凋亡的特征有：
①细胞膜破裂；②DNA降解；③产生炎症体；④活化的IL-1β和IL-18的释放。
2.细胞毒性淋巴细胞
细胞毒性淋巴细胞是一类主要的免疫效应细胞，主要包含细胞毒性T细胞（CTLs）或自然杀伤细胞（NK cells），杀伤的机制主要有两种：FAS/FASL通路和Perforin/Granzymes通路，普遍认为后者是主要杀伤机制。
1.作者前期文章证明了细胞焦亡相关的主要蛋白家族Gasdermin，但是这个蛋白家族是否在CTLs和NKcells杀伤靶细胞过程中发挥作用呢？还从来没有人阐明。于是作者构建了含有肿瘤细胞（293T）和NK细胞的共培养杀伤体系。通过WB和荧光染色技术发现当过表达GSDBM蛋白时，杀伤实验中靶细胞的焦亡增多。作者进一步使用caspase抑制剂，发现这个过程不依赖于caspase途径。而使用NK细胞颗粒酶释放抑制剂，抑制了Granzyme蛋白，发现细胞焦亡明显减少。
Fig 1 GSDMB与细胞焦亡的相关性
2.紧接着作者开始研究GSDMB和Granzyme的关系，作者构建了五种人类Granzymes进行实验，发现Granzyme A（GZMA)可以高效切割GSDMB蛋白，产生30KD、16KD片段。作者为了找到具体的作用位点，使用Edman测序证明第244位和229位的赖氨酸（Lysine）是切割位点。并通过点突变证明Lys244是最主要的切割位点。通过形态和LDH释放的方法说明切割GSDMB后细胞才发生焦亡。以上数据论证了GZMA切割GSDMB是细胞焦亡的充分必要条件。
Fig 2 GASMB可以特异切割条带
3.前面发现了切割的现象，那么它的作用是什么呢？作者利用电转法表达了有活性的GZMA蛋白。作者通过电转的方法将活性GZMA蛋白转入细胞内部，导致GSDMB阳性细胞发生剧烈焦亡，当敲除GSDMB基因后，则不发生焦亡。接着，作者在NK细胞杀伤体系和CTLs细胞杀伤体系中敲低GZMA，证明其在细胞毒性发挥过程的作用。而且IFN-α，IFN-β，IFN-γ和TNF-α能上调GSDMB的表达，尤其是IFN-γ，可以增加上述体系对靶细胞的杀伤力。
Fig3验证GZMA在其他细胞中的作用
4.GZMA-GSDMB的机制在体内水平是否发挥作用呢？于是作者设计了一系列实验。首先作者构建酶活位点突变体细胞，与anti CD19 CAR-T cell共培养，仅在CAR T细胞表达GSDM时，才会引起293T细胞的焦亡，导致钙黄绿素泄露。相反，沉默CAR T细胞的GZMA表达，可以逆转这个过程。而且在人的原代T细胞中GSDMB也有切割现象。进一步左右在小鼠中构建GZMA同源序列（mGZMA），可以在小鼠脾脏CTL中发现GSDMB依赖的焦亡。
上述实验在小鼠体内构建了一套适用的切割体系，并成功验证GSDMB介导的焦亡。
而且作者在小鼠结肠癌细胞系CT26细胞中过表达了野生型GSDMB还有突变型GSDMB，发现野生型GSDMB可以增加anti PD-1的疗效，表现为移植瘤体积减小。
Fig 4切割导致的细胞焦亡途径在体外的细胞杀伤途径中也存在
Fig 5GZMA裂解GSDMB促进小鼠肿瘤的清除
文章概念图
1、表征焦亡：
1）光学显微镜:细胞质特征性膨胀透亮改变；
2)Calcein-AM染色和碘化丙啶（PI）：分别对活细胞和死细胞染色。
3）lactate dehydrogenase (LDH)释放检测
2、细胞共培养：
1）人源细胞：NK细胞（NK-92MIvsYTS），T细胞（anti-CD19 CAR T cell，NY-ESO-1–specific TCR T cells），肿瘤细胞（293T ,HeLa, A375, SW480，SW837, OE19, SKCO1，HCC1954）
2）鼠源细胞：（表达人源GSDMB，被鼠源GZMA杀伤）
CT26小鼠结肠癌细胞（PDL1抗体敏感），MC38，MouseCTL (OT-1)
3、检测切割：Edmansequencing蛋白测序
作者对原来公认的perforin细胞焦亡途径进行了补充，首先发现GSDMB影响细胞焦亡的表型，紧接着证明了GZMA对GSDMB的切割作用，随后对这种切割作用的体内体外功能进行了阐述，最后使用antiPD1药物进行动物实验，进一步证明了这个机制的治疗转化意义。思路十分清晰，先发现表型，再验证功能，最后应用目前临床应用的药物。
文章的创新点在于，从生化→细胞→细胞间交互，层层深入论证。以前人们通常认为是perforin打孔，现在多了一条路，GSDMB-N也可以打孔，补充了新的细胞焦亡概念。启发：简单的逻辑，新颖的故事，作者在前期基础上找到了一个新的切割机制。虽然我们暂时不能像大牛一样拓宽领域的认知，但是我们多读文献，像大牛一样多质疑，多argue，有自己的想法，多提出自己的问题。
比如笔者：凋亡和焦亡过程是否有交叉？没有GSDMB的时候发生凋亡，有GSDMB的时候有焦亡，这两种细胞程序性死亡过程是否存在时间上的关系？希望小伙伴们可以一起思考讨论。
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