发文思路，免疫检查点基因（ICG）在肿瘤和免疫细胞上的表达模式的8分+

免疫检查点基因（ICG）在规避自身反应性方面起着关键作用，并代表开发癌症治疗方法的新靶标。但是，仍缺乏对ICGs在泛癌水平上的表达谱及其与患者对基于免疫检查点封锁（ICB）疗法反应的相关性综合分析。在本研究中，作者使用来自哺乳动物基因组项目（FANTOM5）功能注释的肿瘤和免疫细胞RNA序列数据，识别了ICG的三种表达模式。研究了ICG的表达模式与患者生存和对ICB治疗的反应之间的相关性。ICG的表达模式在各种癌症中均很强，并且ICG的上调与高淋巴细胞浸润和良好的预后呈正相关。此外，作者建立了一个模型（ICGe），使用ICG表达的五个特征来预测患者对ICB治疗的反应。六个独立数据集的验证方案包含261位CTLA-4和PD-1阻断免疫疗法患者的数据，ICGe达到0.64-0.82曲线下的面积，表现出强劲的性能，并且优于其他mRNA的预测指标。总之，本研究揭示了ICG的表达模式以及ICG与ICB反应之间的潜在相关性，这有助于了解ICG在ICB信号通路和其他抗癌治疗中的机制。

1.ICG在肿瘤和免疫细胞中的表达模式

从之前的研究中，作者确定了79个ICG。这些ICG主要参与配体-受体相互作用，并对免疫活性具有不同的影响，包括抑制，刺激或两者结合。为了更好地表征ICG的表达模式，主要在肿瘤或免疫细胞或两者中表达的ICG，作者参考了110种免疫细胞和187种肿瘤细胞的表达谱 FANTOM5中的50个组织，其中79个ICG中有68个具有表达值。值得注意的是，t-SNE和PCA分析的结果表明，这68种ICG的表达谱可区分肿瘤细胞和免疫细胞，而功能相反（免疫抑制或激活）的免疫细胞则分为不同的簇，如下图A所示。

随后，将68种ICG根据其表达方式分为三类：肿瘤细胞显性（TCICG），免疫细胞显性（IC-ICG）以及肿瘤和免疫细胞平衡（TIC-ICG）（如下图B）中显示了ICG的数量。PVR和CD276是主要在肿瘤细胞中表达的免疫受体，被分类为TC-ICG（下图C）。68种ICG中的大多数主要在免疫细胞中表达，例如ICOS，CD86，CD40LG，CTLA4和主要的组织相容性复合体（MHC）I和II类基因家族成员（下图B）相关。

另外，作者想知道ICG的表达模式是否通用。作者分析了不同组织之间每个ICG的表达水平，发现在25个组织中ICG的表达模式相似。此外，两个scRNA-seq数据集包含19例黑色素瘤患者和11例乳腺癌患者的数据，用于测量ICG的表达模式在组织和细胞水平之间是否一致。在这两个单细胞数据集中，除了ICG HLA-DRB4，KIR2DS2和KIR2DL2，已检测到68种ICG中有65种表达。有趣的是，ICG的表达模式表明FANTOM5和scRNA-seq数据之间存在适度的一致性（如下图D所示），这表明用于对ICG进行分类的标准是合理的。

2.TCGA癌症中ICG的表达特征及其与临床结局的关系

作者分析了TCGA的9744份肿瘤样本中ICG的表达谱，发现每个ICG在不同的肿瘤类型之间具有一致的趋势（下图A）。来自MHC I类和II类家族的ICG的表达水平高于其他家族。在大多数癌症中，肿瘤样本与正常样本之间ICG亚群的表达水平存在显著差异（如下图B）。但是，在TCGA癌症人群中，ICG亚组的平均表达具有相似的趋势，在大多数癌症中，IC-ICG的表达水平明显低于TC-ICG（如下图C）。

在白细胞相关性癌症中，如淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤，急性髓细胞性白血病（LAML）和胸腺瘤（THYM），IC-ICGs的表达水平高于TC-ICGs（如下图C）。使用单变量Cox回归的HR探索了ICG表达（TC-ICG和IC-ICG）与TCGA患者无进展生存期（PFS）的关联（如下图D）。IC-ICGs的高表达水平表明TCGA癌症中一半以上的患者死亡风险较低（HR <1；下图D），而TC-ICGs的高表达水平则具有相反的作用（HR> 1；下图D）。

作者还对14种TCGA癌症的肿瘤和成对的正常样本之间的ICG进行差异表达分析。作者发现DE ICG具有很强的癌症特异性特征（下图A）。与肾脏肾透明（KIRC）细胞中的相邻样本相比，病灶中大多数ICG均上调。这些发现表明，患有这些癌症的患者可能处于“immune-hot”状态，可能适合进行免疫治疗。除了TC-ICG以外，在比较肺鳞状细胞癌（LUSC）和肺腺癌（LUAD）时，ICGs的表达下调了，这表明病灶处于“immune-desert”状态。此外，作者观察到来自配体-受体对的ICG在不同癌症中显示出相似的差异表达分布（如下图B）。在超过50％的癌症中，大多数配体的表达水平与其受体呈显著正相关（如下图C）。

3.ICG上调与高免疫浸润和良好预后呈正相关

此外，作者分析了ICGs的表达水平和表达谱与癌症中浸润淋巴细胞丰度之间的关系。TIMER用于研究六种类型免疫细胞（B细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，树突状细胞，巨噬细胞和嗜中性粒细胞）的丰度。有趣的是，LUSC，KICH和结肠腺癌（COAD）在正常组织中的淋巴细胞浸润水平高于病灶（如下图A），而在KIRC，HNSC和KIRP中观察到相反的现象（如下图A）。

每个免疫细胞的浸润水平显示出相似的趋势（如下图B）。值得注意的是，作者发现上调的ICG评分与TCGA癌病灶中浸润淋巴细胞的高水平显著正相关（如下图C所示）。作者注意到，ICG与TIMER的标记不重叠，这表明TIMER预测的上调ICG与高水平浸润淋巴细胞之间的正相关性不是由标记基因重叠引起的偏倚（图C中的维恩图）。根据免疫状态，可以将肿瘤分为免疫hot（无论肿瘤在外部如何都具有明显的免疫浸润性），免疫cold（在肿瘤区域内外的低密度）和免疫excluded（肿瘤区域外为高密度，肿瘤区域内为低密度）。作者发现胃腺癌和食管癌是免疫热肿瘤，而KICH，LUSC，COAD和子宫内膜子宫内膜癌是免疫排斥的肿瘤（如下图D）。原则上，病灶中较高的浸润淋巴细胞水平可以帮助消除肿瘤细胞，从而改善预后。因此，作者分析了浸润淋巴细胞差异（肿瘤与正常）与患者PFS的关系。作者发现，肿瘤中浸润淋巴细胞的水平较高，表明在浸润性乳腺癌（BRCA），KIRC和LUAD中预后较好（如下图E）。

接下来，作者使用ICG评分重新定义肿瘤的免疫状态。ICG分数大于肿瘤类型中值的肿瘤样本被认为具有较高的免疫活性，其它肿瘤样本被认为免疫活性较低，并且在TCGA癌症中评估了这些评分的分布（如下图A所示）。值得注意的是，ICG评分可作为22种TCGA癌症的有价值且独立的预后指标，高ICG评分可预测良好的PFS和OS（如下图B），尤其是对于BRCA，KIRC，LIHC，LUAD和THCA（ 如下图C和D）。这些结果表明，ICG评分可以作为研究癌症免疫活性的良好标志物，并可以作为患者生存的良好预后指标，表明其在免疫治疗中的潜在作用。

4.基于ICG表达的模型可预测患者对CTLA-4和PD-1阻断剂对免疫疗法的反应

先前的研究表明，TIL的水平始终与ICB反应有关。考虑到ICG像TIL一样似乎是患者生存的有价值的预后指标（如下图所示）。

作者分析了ICG在预测免疫疗法反应方面的作用。首先，作者生成了340个包含ICG表达谱的各种组合的特征，随后，作者使用排名算法评估了特征的重要性，该算法量化了高和低水平的9个特征（B细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，树突状细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，TIL，TMB和CTL）之间ICG功能的差异 ，如下图A所示。最后，选择了五种特征来构建逻辑回归模型（称为ICGe），以预测患者对ICB免疫疗法的反应。

然后，作者通过预测胃癌和黑色素瘤患者对ICB治疗的反应来评估ICGe模型的性能，而无需进行任何进一步的培训。在五个独立研究的六个ICB数据集的场景中，ICGe的AUC从0.64上升到0.82（如下图B），其中包含抗PD1或抗CTLA4或两种治疗组合的患者的RNA-Seq数据。ICGe模型的整体性能比其他预测变量更健壮和准确（下图C）。

本研究表征了ICG在肿瘤和免疫细胞上的表达模式。发现ICG的表达水平与肿瘤中免疫细胞的浸润呈正相关。ICG打分确定了免疫性热肿瘤的程度，并促进了更好的临床结果。进而，构建了一种使用ICG表达式预测ICB响应的模型（ICGe），其性能优于其他基于表达的预测器。