Nucleic Acids Research | 长非编码RNA如何上调目的基因表达

日期:2020/11/02

Nucleic Acids Research | 长非编码RNA如何上调目的基因表达

杂志:Nucleic Acids Research
杂志影响因子:11.5
原文标题:SINEUP long non-coding RNA acts via PTBP1 and HNRNPK to promote translational initiation assemblies
原文链接:https://academic.oup.com/nar/article/48/20/11626/5936032
来源:日本Yokohama City University

Nucleic Acids Research | 长非编码RNA如何上调目的基因表达

摘要

SINEUPs是一类长的非编码RNAlncRNA),它包含SINE元件,并且能上调目标mRNA的翻译。尽管尚不清楚分子机制的基础,但它们已在广泛的应用中进行了研究,包括生物学和治疗工具。这里专注于目标mRNASINEUP RNA的亚细胞分布,将这些转录本的表达载体共转染到人类胚胎肾细胞(HEK293T / 17)中,以研究翻译调控网络。结果表明,靶向的mRNASINEUP RNA在细胞质中的共定位是关键的现象。确定PTBP1HNRNPKRNA结合蛋白必需的。这些蛋白质有助于SINEUP RNA亚细胞分布和翻译起始复合物的组装,从而导致靶mRNA的翻译增强。这些发现将促进对有效蛋白质翻译中涉及的调节性RNA所用机制的理解。


内容

目前我们知道的有超过70%的哺乳动物基因组能够被转录为RNA然而这些RNA中的大多数不编码蛋白质,它们被称为非编码RNA发现大部分非编码RNA是与编码RNA成的正义-反义转录本对,在转录水平上起到共同调控作用。尽管已经对这些非编码RNA中的一些进行了深入研究,例如转移RNAtRNA)和核糖体RNArRNA),但98.5%的长非编码RNAlncRNA)的生物学功能仍然未知,lncRNA长度大于200个核苷酸的RNA编码。重要的是,一些lncRNA在转录或翻译水平上具有调节功能。


先前发现,AS-Uchl1是一种天然反义(ASlncRNA,能够增强其在小鼠多巴胺能细胞中的正义Uchl1(泛素羧基末端水解酶L1mRNA的翻译。嵌入AS-Uchl1的功能元件是一个反向SINEB2(短散布的核元件B2),SINEB2AS-Uchl1中作为起效应域(effector domainED)的作用,对于上调蛋白质合成至关重要。该元素增强了UCHL1蛋白水平,而没有改变Uchl1 mRNA的数量。在小鼠多巴胺能神经元中,成熟的Uchl1 mRNA主要位于细胞质中,而天然AS-Uchl1 RNA处于稳定状态时位于细胞核中。有趣的是,在雷帕霉素诱导的应激条件下,内源性AS-Uchl1 RNA被转运至细胞质,从而增加了Uchl1 mRNA与重质多核糖体的缔合并增强了其翻译。


该团队还发现了,其他包含SINE的天然反义lncRNA,它们都具有特异性上调部分重叠的正义mRNA的翻译,并将这种功能类lncRNA称为“ SINEUP”除了倒置的SINEB2功能元件外,SINEUPs还需要一个反义序列,称为结合域(BD),与目标有义mRNA重叠。重要的是,已经显示出SINEUP在不同的细胞系和生物中具有广泛的功能。在这项研究中,使用了合成的SINEUP靶向绿色荧光蛋白(SINEUP-GFP),阐明了合成SINEUPs增强目标mRNA的翻译背后的机制,特别关注RNA亚细胞分布及其对蛋白质翻译的贡献。


SINEUP-GFP增强EGFP mRNA的翻译


为了确认SINEUP构建体的翻译上调活性,这里合成出了针对EGFP mRNASINEUP(图1A)。先前曾报道,当克隆到pCS2 +质粒中时,SINEUP-GFP比克隆到pcDNA3.1质粒中更有效地增强EGFP水平。由于启动子,稳定性和聚腺苷酸化状态的不同,由不同质粒产生的RNA的表达水平通常也不同。在本研究中,发现SINEUP RNA转录本的水平(以每个细胞的拷贝数衡量)pCS2 +pcDNA3.1高约1.5倍。与先前的研究一致,pCS2 +中的合成SINEUP-GFP与无插入对照(不含SINEUP构建体的载体)相比,显示出约2倍的EGFP水平诱导(图1BC)。SINEUP-SCRSINEUP-ΔSB2并未显着提高EGFP水平,但是Alu元素缺失突变体(SINEUP-ΔAlu)和SINEUP-GFP却提高了EGFP水平。因为没有一个构建体显着影响EGFP mRNA(图1D),所以结果表明EGFP mRNA的翻译是由SINEUP-GFPSINEUP-ΔAlu诱导的,而不是由SINEUP-SCRSINEUP-ΔSB2诱导的。

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SINEUP RNAEGFP mRNA在细胞质中共定位


先前的研究表明,雷帕霉素处理后,天然SINEUP RNAAS-Uchl1)被转运至细胞质,从而增强了Uchl1 mRNA的翻译。这里假设SINEUP RNA的亚细胞分布能对调节靶向对mRNA的翻译起作用。为了阐明EGFP mRNASINEUP RNA的动态分布,在将EGFPSINEUP表达载体(SINEUP-GFP或缺失突变体)共转染入HEK293T / 17细胞后,进行了RNA FISH(荧光原位杂交)。观察到EGFP mRNA主要定位在细胞质中(图2Adins),而SINEUP RNA既分布在细胞核中,又分布在细胞质中(图2Achmr)。在细胞核中,SINEUP RNA位于整个核质中,但不在核仁中。

SINEUP RNA形成密集聚集的斑点,这些斑点与几种核细胞器标记物部分共定位。在细胞质中,SINEUP RNAEGFP mRNA共定位,出现为分布在整个细胞质中的许多小点(图2Au,箭头)。对于SINEUP-GFP37.60%)和SINEUP-ΔAluRNA31.12%),与对照,翻译上调活性受损的SINEUP RNASINEUP-SCRSINEUP-ΔSB2)相比,SINEUP-ΔAluSINEUP-GFP显示出更频繁的重叠峰(图2B,箭头)。这表明BDED结构域既有助于翻译的上调,又有助于EGFP mRNASINEUP RNA的共定位。当单独转染EGFP表达载体时,如共转染所观察到的那样,大多数EGFP mRNA在细胞质中分布(图2Adins)。相反,当单独转染SINEUP RNA的表达载体时,SINEUP RNA优先分布在细胞核中(图2Cehk)。当单独转染SINEUP-GFP载体时,在细胞核中检测到的SINEUP-GFP RNA的百分比为60.6%(图2D);当SINEUP载体与EGFP载体共转染时,这一比例显着降低到49.3%,这意味着更多的SINEUP-GFP RNA转移到了细胞质。对于SINEUP-ΔAlu观察到了类似的发现,但对于SINEUP-SCRSINEUP-ΔSB2没有观察到显着差异。由RNA表达的qPCR测量支持,当这些转录本与EGFP mRNA共转染时,SINEUP-ΔAluSINEUP-GFP RNA的亚细胞分布转移到细胞质中,而当单独转染SINEUP载体时,胞质SINEUP RNA减少。在存在EGFP mRNA的情况下,通过将SINEUP RNA输出到细胞质中可以增强翻译上调。

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SINEUP RNA结合蛋白的鉴定和功能分析


作者假设SINEUP RNA结合蛋白(RBPs)可能在EGFP表达中起关键作用。为了鉴定细胞中的SINEUP RBP,使用了RNA染色质分离纯化(ChIRP)方法并进行优化,然后进行质谱(MS)分析。通过对SINEUP-SCRSINEUP-ΔSB2SINEUP-ΔAluSINEUP-GFP转染进行三个或更多独立实验,检测到了多个SINEUP RBP。为了确定哪些RBPSINEUP-GFP的翻译上调活性最重要,通过质谱数据库搜索引擎Mascot的得分计算,同时去除了非特异性结合蛋白(也可以在带有珠子的样品中检测到并标记为LacZ探针),以鉴定特异性RBP,最终选择了几种具有高可靠性和特异性的候选SINEUP-GFP RBP。然后,将SINEUP-GFP RBP与其他SINEUP突变体的RBP进行了比较,并观察到几种核质穿梭相关蛋白,是在SINEUP-GFP RBP中特异富集(图3)。

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敲除SINEUP结合蛋白


排除核糖体蛋白后,在散点图中进行了siRNA介导的丰富蛋白(PTBP1HNRNPKDNAJC1EEF2EF1A1HNRNPMHNRNPULMNB1)的敲低操作,以评估其对上调的影响SINEUP-GFP蛋白翻译的过程(图4)。实验表明,敲低PTBP1(图4A1A2)或HNRNPK(图4B1B2)显着降低了SINEUP-GFP的翻译上调活性。用杂乱的siRNA(阴性对照)转染细胞不会影响SINEUP-GFP的翻译上调活性(图4C1C2)。有趣的是,与阴性对照siRNA转染的细胞相比,PTBP1(图4Df–j)和HNRNPK(图4Dk–o)的敲低显着降低了EGFP mRNASINEUP-GFP RNA在细胞质中的共定位。此外,它显着增加了SINEUP-GFP RNA的核保留:PTBP1敲除为76.4%,HNRNPK敲除为61.4%,而对照细胞为49.7%(图4F),表明细胞质SINEUP RNA减少。特别是,敲低PTBP1会显着减少细胞质中的SINEUP RNA,而敲低HNRNPK则会减少整个细胞中的SINEUP RNAEGFP mRNA。这些结果表明,当敲低后HNRNPK水平降低时,SINEUP RNAEGFP mRNA不足以使SINEUP发挥功能。PTBP1敲低后全细胞裂解液(WCL)中的SINEUP RNA水平没有显着变化,而PTBP1敲低后仅在细胞质水平上观察到SINEUP RNA的减少。这表明PTBP1对转录物表达水平和EGFP mRNA翻译机制没有影响,但是对SINEUP RNA亚细胞定位有影响。

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总结


本文揭示了SINEUP RNA与诸如BPBP1(聚嘧啶束结合蛋白-1)和HNRNPK(异质核糖核蛋白K)之类的核质蛋白相互作用,这对于RNA定位和翻译起始装配是必不可少的。证明了合成SINEUP RNA在增强其靶mRNA的翻译中起着关键作用。

i)与靶mRNA在细胞质中共定位,ii)与SINEUP RBP相互作用以影响SINEUP RNA的分布,iii)通过参与翻译起始装配来增加靶mRNA向多核糖体的转移。

参考:Human Cell Atlas Developmental Clinical and Rare Disease Seminar

版权声明:Robin 发表于 2022年3月7日 pm7:18。
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