日期：2020/11/02
杂志：Nucleic Acids Research
杂志影响因子：11.5
原文标题：SINEUP long non-coding RNA acts via PTBP1 and HNRNPK to promote translational initiation assemblies
原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/48/20/11626/5936032
来源：日本Yokohama City University
摘要
SINEUPs是一类长的非编码RNA（lncRNA），它包含SINE元件，并且能上调目标mRNA的翻译。尽管尚不清楚分子机制的基础，但它们已在广泛的应用中进行了研究，包括生物学和治疗工具。这里专注于目标mRNA和SINEUP RNA的亚细胞分布，将这些转录本的表达载体共转染到人类胚胎肾细胞（HEK293T / 17）中，以研究翻译调控网络。结果表明，靶向的mRNA和SINEUP RNA在细胞质中的共定位是关键的现象。确定PTBP1和HNRNPK是RNA结合蛋白必需的。这些蛋白质有助于SINEUP RNA亚细胞分布和翻译起始复合物的组装，从而导致靶mRNA的翻译增强。这些发现将促进对有效蛋白质翻译中涉及的调节性RNA所用机制的理解。
内容
目前我们知道的有超过70％的哺乳动物基因组能够被转录为RNA。然而这些RNA中的大多数不编码蛋白质，它们被称为非编码RNA。发现大部分非编码RNA是与编码RNA成的正义–反义转录本对，在转录水平上起到共同调控作用。尽管已经对这些非编码RNA中的一些进行了深入研究，例如转移RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA），但98.5％的长非编码RNA（lncRNA）的生物学功能仍然未知，lncRNA长度大于200个核苷酸的RNA编码。重要的是，一些lncRNA在转录或翻译水平上具有调节功能。
先前发现，AS-Uchl1是一种天然反义（AS）lncRNA，能够增强其在小鼠多巴胺能细胞中的正义Uchl1（泛素羧基末端水解酶L1）mRNA的翻译。嵌入AS-Uchl1的功能元件是一个反向SINEB2（短散布的核元件B2），SINEB2在AS-Uchl1中作为起效应域（effector domain，ED）的作用，对于上调蛋白质合成至关重要。该元素增强了UCHL1蛋白水平，而没有改变Uchl1 mRNA的数量。在小鼠多巴胺能神经元中，成熟的Uchl1 mRNA主要位于细胞质中，而天然AS-Uchl1 RNA处于稳定状态时位于细胞核中。有趣的是，在雷帕霉素诱导的应激条件下，内源性AS-Uchl1 RNA被转运至细胞质，从而增加了Uchl1 mRNA与重质多核糖体的缔合并增强了其翻译。
该团队还发现了，其他包含SINE的天然反义lncRNA，它们都具有特异性上调部分重叠的正义mRNA的翻译，并将这种功能类lncRNA称为“ SINEUP”。除了倒置的SINEB2功能元件外，SINEUPs还需要一个反义序列，称为结合域（BD），与目标有义mRNA重叠。重要的是，已经显示出SINEUP在不同的细胞系和生物中具有广泛的功能。在这项研究中，使用了合成的SINEUP靶向绿色荧光蛋白（SINEUP-GFP），阐明了合成SINEUPs增强目标mRNA的翻译背后的机制，特别关注RNA亚细胞分布及其对蛋白质翻译的贡献。
SINEUP-GFP增强EGFP mRNA的翻译
为了确认SINEUP构建体的翻译上调活性，这里合成出了针对EGFP mRNA的SINEUP（图1A）。先前曾报道，当克隆到pCS2 +质粒中时，SINEUP-GFP比克隆到pcDNA3.1质粒中更有效地增强EGFP水平。由于启动子，稳定性和聚腺苷酸化状态的不同，由不同质粒产生的RNA的表达水平通常也不同。在本研究中，发现SINEUP RNA转录本的水平（以每个细胞的拷贝数衡量）pCS2 +比pcDNA3.1高约1.5倍。与先前的研究一致，pCS2 +中的合成SINEUP-GFP与无插入对照（不含SINEUP构建体的载体）相比，显示出约2倍的EGFP水平诱导（图1B，C）。SINEUP-SCR和SINEUP-ΔSB2并未显着提高EGFP水平，但是Alu元素缺失突变体（SINEUP-ΔAlu）和SINEUP-GFP却提高了EGFP水平。因为没有一个构建体显着影响EGFP mRNA（图1D），所以结果表明EGFP mRNA的翻译是由SINEUP-GFP和SINEUP-ΔAlu诱导的，而不是由SINEUP-SCR或SINEUP-ΔSB2诱导的。
图1
SINEUP RNA与EGFP mRNA在细胞质中共定位
先前的研究表明，雷帕霉素处理后，天然SINEUP RNA（AS-Uchl1）被转运至细胞质，从而增强了Uchl1 mRNA的翻译。这里假设SINEUP RNA的亚细胞分布能对调节靶向对mRNA的翻译起作用。为了阐明EGFP mRNA和SINEUP RNA的动态分布，在将EGFP和SINEUP表达载体（SINEUP-GFP或缺失突变体）共转染入HEK293T / 17细胞后，进行了RNA FISH（荧光原位杂交）。观察到EGFP mRNA主要定位在细胞质中（图2A，d，i，n，s），而SINEUP RNA既分布在细胞核中，又分布在细胞质中（图2A，c，h，m，r）。在细胞核中，SINEUP RNA位于整个核质中，但不在核仁中。
SINEUP RNA形成密集聚集的斑点，这些斑点与几种核细胞器标记物部分共定位。在细胞质中，SINEUP RNA与EGFP mRNA共定位，出现为分布在整个细胞质中的许多小点（图2A，u，箭头）。对于SINEUP-GFP（37.60％）和SINEUP-ΔAluRNA（31.12％），与对照，翻译上调活性受损的SINEUP RNA（SINEUP-SCR和SINEUP-ΔSB2）相比，SINEUP-ΔAlu和SINEUP-GFP显示出更频繁的重叠峰（图2B，箭头）。这表明BD和ED结构域既有助于翻译的上调，又有助于EGFP mRNA和SINEUP RNA的共定位。当单独转染EGFP表达载体时，如共转染所观察到的那样，大多数EGFP mRNA在细胞质中分布（图2A，d，i，n，s）。相反，当单独转染SINEUP RNA的表达载体时，SINEUP RNA优先分布在细胞核中（图2C，e，h，k）。当单独转染SINEUP-GFP载体时，在细胞核中检测到的SINEUP-GFP RNA的百分比为60.6％（图2D）；当SINEUP载体与EGFP载体共转染时，这一比例显着降低到49.3％，这意味着更多的SINEUP-GFP RNA转移到了细胞质。对于SINEUP-ΔAlu观察到了类似的发现，但对于SINEUP-SCR或SINEUP-ΔSB2没有观察到显着差异。由RNA表达的qPCR测量支持，当这些转录本与EGFP mRNA共转染时，SINEUP-ΔAlu和SINEUP-GFP RNA的亚细胞分布转移到细胞质中，而当单独转染SINEUP载体时，胞质SINEUP RNA减少。在存在EGFP mRNA的情况下，通过将SINEUP RNA输出到细胞质中可以增强翻译上调。
图2
SINEUP RNA结合蛋白的鉴定和功能分析
作者假设SINEUP RNA结合蛋白（RBPs）可能在EGFP表达中起关键作用。为了鉴定细胞中的SINEUP RBP，使用了RNA染色质分离纯化（ChIRP）方法并进行优化，然后进行质谱（MS）分析。通过对SINEUP-SCR，SINEUP-ΔSB2，SINEUP-ΔAlu和SINEUP-GFP转染进行三个或更多独立实验，检测到了多个SINEUP RBP。为了确定哪些RBP对SINEUP-GFP的翻译上调活性最重要，通过质谱数据库搜索引擎Mascot的得分计算，同时去除了非特异性结合蛋白（也可以在带有珠子的样品中检测到并标记为LacZ探针），以鉴定特异性RBP，最终选择了几种具有高可靠性和特异性的候选SINEUP-GFP RBP。然后，将SINEUP-GFP RBP与其他SINEUP突变体的RBP进行了比较，并观察到几种核质穿梭相关蛋白，是在SINEUP-GFP RBP中特异富集（图3）。
图3
敲除SINEUP结合蛋白
排除核糖体蛋白后，在散点图中进行了siRNA介导的丰富蛋白（PTBP1，HNRNPK，DNAJC1，EEF2，EF1A1，HNRNPM，HNRNPU和LMNB1）的敲低操作，以评估其对上调的影响SINEUP-GFP蛋白翻译的过程（图4）。实验表明，敲低PTBP1（图4A1和A2）或HNRNPK（图4B1和B2）显着降低了SINEUP-GFP的翻译上调活性。用杂乱的siRNA（阴性对照）转染细胞不会影响SINEUP-GFP的翻译上调活性（图4C1和C2）。有趣的是，与阴性对照siRNA转染的细胞相比，PTBP1（图4D，f–j）和HNRNPK（图4D，k–o）的敲低显着降低了EGFP mRNA和SINEUP-GFP RNA在细胞质中的共定位。此外，它显着增加了SINEUP-GFP RNA的核保留：PTBP1敲除为76.4％，HNRNPK敲除为61.4％，而对照细胞为49.7％（图4F），表明细胞质SINEUP RNA减少。特别是，敲低PTBP1会显着减少细胞质中的SINEUP RNA，而敲低HNRNPK则会减少整个细胞中的SINEUP RNA和EGFP mRNA。这些结果表明，当敲低后HNRNPK水平降低时，SINEUP RNA和EGFP mRNA不足以使SINEUP发挥功能。PTBP1敲低后全细胞裂解液（WCL）中的SINEUP RNA水平没有显着变化，而PTBP1敲低后仅在细胞质水平上观察到SINEUP RNA的减少。这表明PTBP1对转录物表达水平和EGFP mRNA翻译机制没有影响，但是对SINEUP RNA亚细胞定位有影响。
图4
总结
本文揭示了SINEUP RNA与诸如BPBP1（聚嘧啶束结合蛋白-1）和HNRNPK（异质核糖核蛋白K）之类的核质蛋白相互作用，这对于RNA定位和翻译起始装配是必不可少的。证明了合成SINEUP RNA在增强其靶mRNA的翻译中起着关键作用。
（i）与靶mRNA在细胞质中共定位，（ii）与SINEUP RBP相互作用以影响SINEUP RNA的分布，（iii）通过参与翻译起始装配来增加靶mRNA向多核糖体的转移。
参考：Human Cell Atlas Developmental Clinical and Rare Disease Seminar
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