Nature Methods 2020年度技术：空间转录组

论文写作1年前 (2022)发布 Robin

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导读

空间转录组学是单细胞分析后的下一波热潮，这是一个非常活跃的领域，新的技术开辟了新的科研角度。该技术不仅可以获取转录组数据并解析细胞在组织中的位置，还能够在空间背景下对基因表达进行更细致的研究。空间转录组学的分析系统开发和生信数据处理将会是该领域各大公司的研发重点及商业价值所在。

如果研究人员正在榨果汁，那可能是休息时间，也可能是在准备用于批量RNA测序的样品，将样品组织均质化后进行分析，这样就可以从组织细胞的mRNA中检测到平均基因的表达情况，即转录组。开发单细胞RNA测序（scRNA-seq）时，它可以对每个细胞的转录组进行更精准的评估。在scRNA-seq中，研究人员将细胞从组织中分离出来，如根据基因表达区分细胞类型。艾伦脑科学研究所的负责人曾红葵说，利用单细胞进行研究更像是做水果沙拉而不是果汁。现在，利用空间转录组技术，科学家可以获取转录组数据并解析这些细胞在组织中的位置^1-3。与曾红葵一起接受采访的艾伦研究所研究员Bosiljka Tasic说：“空间转录组学就像是水果馅饼，你很确切地知道每一块水果在哪，以及每个水果与另一个之间的关系是什么”。她认为，人们可以从单细胞和空间组学中获取更多信息，而那种“果汁”式的方法很快就会过时。空间分析尚无法提供所有单个细胞范围的转录组信息，但该领域正朝着单个细胞的方向快速发展。卡罗林斯卡研究所的生物学家Sten Linnarsson说，生物学“完全是关于环境的”。他认为，空间转录组学是单细胞分析后的下一波热潮，这对人类疾病的研究特别有用，因为人类疾病通常始于单细胞并在空间上扩散。“如果我有个梦想，那便是几年后我们将会拥有时空单细胞组学应用于活体组织的技术”，这为单细胞领域带来了全面的发展。

欢迎进入空间组学时代

一些实验室热衷于在空间范围内定量mRNA，并已经采用了可以在神经科学、癌症研究或发育生物学等领域提供空间转录组数据的一系列的方法。华盛顿大学的Jay Shendure说：“我认为未来是光明的”。他更感兴趣的是如何应用这些方法获得细胞结合状态、历史和命运的发育空间图谱。曾红葵说：“这是一个非常活跃的领域，新的技术开辟了新的科研角度”。哈佛大学的霍华德·休斯医学研究所研究员庄小威的研究方向为显微镜成像领域。她和她的实验室开发了一种超分辨率显微镜技术，即随机光学重建显微镜（STORM）。当单细胞基因组学出现时，她夜以继日地思考和研究，致力于将影像学和基因组学结合在一起，以获得两全其美的方法。乌得勒支的Hubrecht研究所的物理学家Alexander van Oudenaarden说：“有些技术，尤其是从2012年左右开始出现的，用于捕获空间信息以及单细胞序列，已经融合了在以前是分开的成像、测序和分子表征领域”。他和他的实验室将单细胞和空间转录组学相结合，比较了类胃体和小鼠胚胎中的基因表达。对单细胞的研究起源于19世纪，例如Rudolf Virchow观察到疾病始于细胞，而不是整个有机体。十年前，van Oudenaarden等人利用显微镜来研究细胞在机体生长过程中的发育、生长和迁移。“我们总是羡慕测序研究”。van Oudenaarden和他的团队可以制作延时摄影并捕获复杂的过程，但只能用少数荧光蛋白标记基因表达。基因组学实验室可以测量数千个基因。他说，要用组织做到这一点，需要“将它们放入搅拌机中”。现在，可以评估多个单细胞和多个基因，并跟踪细胞的组织背景及其空间属性。他说：“有多种先进的技术可以保存空间信息”。“这是一项非常令人兴奋的技术”。

瑞典的研究人员开发了一种方法，可以对固定的，染色的组织进行成像，透化，并将mRNA附着在一系列标签化的寡核苷酸上。RNA被逆转录；cDNA被测序并产生空间转录组信息。

图片来源：Adapedwithpermissionfromref.⁴,AAAS

正如瑞典皇家理工学院（KTH）生命科学实验室的Joakim Lundeberg及其同事指出的那样，空间组技术可以分为两类，一类是通过光学显微直接揭示组织的基因表达，另一类是涉及原位杂交、原位测序、原位捕获并通过计算机分析从而重构空间数据的技术。曾红葵说，单分子荧光原位杂交技术（smFISH）是空间组技术“基于杂交方法的开端”。在这种方法中，多个带有荧光标记的寡核苷酸与RNA分子结合。来自艾伦研究所生命科学实验室和卡罗林斯卡研究所的研究人员指出，smFISH产生的定量mRNA读数具有“接近100％的检测灵敏度”。

来自KTH的Patrik Ståhl解释说，大约在2009年，卡罗林斯卡研究所的研究员Jonas Frisén开始着手研究在他的实验中，如何从常规组织玻片上获取更多信息。Frisén与KTH的同事Lundeberg取得了联系，Ståhl曾在那儿攻读博士学位。Fredrik Salmén 也曾是KTH的研究生。Salmén成为Lundeberg实验室的博士研究生。Ståhl和Salmén的密切合作产生了空间组解析方法，该方法可以对固定的、染色的组织进行成像，然后进行透化。释放的mRNA通过标签寡核苷酸附着在组织下方的阵列上，从而将它们固定在与组织对应的位置。逆转录后，组织被酶移除，剩下的是附着在寡核苷酸阵列上与空间标签互补的DNA分子。接下来对这些cDNA进行测序，标签阵列保存着转录本的空间位置信息。科学家们致力于捕获阵列中的单个细胞信息。Salmén说：“我们真的很想达到这个维度”，这个方法的分辨率可以达到100微米，即十个细胞。Salmén称，该技术面临着许多挑战，mRNA可能朝多方向扩散，会造成不准确的空间数据或混合表达模式的风险。他们尝试通过多种方式去避免扩散的发生。Ståhl说到：“这是一场漫长的挑战”，然而他和他的团队还在努力，Ståhl和Salmén共享论文的第一作者。Ståhl说道，论文整个完成过程，融合了微阵列、成像、测序和基于标签的生信分析等概念和技术，这改变了他们的科学和职业生涯。Ståhl说，Salmén的主要想法是与荧光核苷酸建立起初步反应，以使细胞的mRNA与阵列表面探针的结合位点可视化，可以由此判断合成的cDNA来自于哪个产生mRNA的位点。Salmén笑着说：“你可以看到所有正在发生事情的位置的荧光足迹，对于我们而言，这是使得其他部分正常工作的巨大垫脚石”，“这个垫脚石甚至让一些不相信的人都坚信许多方法都有更多的潜能”。方法的诞生意味着无数次的失败，这项技术经历了四五年的测试。空间组学技术通过衍生公司Spatial Transcriptomics开始商业化，并于2018年被10x Genomics公司收购并产生了Visium产品。

空间技术通过定位表达的基因来帮助构建地图谱。这里，seqFISH +用于测量小鼠皮层中的10,000个基因。

图片来源：Cai lab, Caltech, I. Strazhnik; adapted with permission from ref.⁵, Springer Nature.

其他空间组学技术

加州理工学院研究员蔡龙表示，成像本质上是基于空间的，也就是三维（3D）的，他的职业生涯也受到空间方法的影响。他说，要使用显微镜获得3D信息，“你只需做z截面”。他回想起加州理工学院的同事Barbara Wold向他提到RNA测序技术会如何。那是十年前，当时第二代测序技术才刚刚诞生。他说：“试想一下，测序实际上就是一个盒子中进行单分子成像”。一款测序仪，“单分子显微镜”，可以对200个碱基对读取，这些读取来自200轮化学反应和成像。基因组学方法产生的细胞信息，对比单分子荧光免疫杂交技术，可以产生更多的分子标记对单细胞基因组信息进行成像。蔡龙应用超分辨率显微镜辨别细胞中的荧光点，这些点可以标记RNA、DNA或蛋白质。其实验室的方法seqFISH5和seqFISH+6使用带有荧光的探针与带有标签序列的mRNA进行多轮连续的杂交。在组织细胞中将转录本固定，每一轮杂交后都将探针移除，以方便进行下一轮不同荧光团的杂交。荧光信号序列可以为我们提供转录组数据的空间信息。蔡龙说：“我们可以直接在原位进行测序读数，而不再需要将成像信息转换成测序读数”。同时他成立了一家名为空间基因组学（Spatial Genomics）的初创公司来使seqFISH达到商业化目的。

在蔡龙看来，scRNA-seq技术可以为研究人员提供单细胞分辨率，但目前，组织成像技术还达不到。分辨率对于科学研究至关重要，因为在人们感兴趣的组织区域包含有多种细胞类型，如果没有足够的分辨率，那么就会出现“完全错误的图像”，并且如果一种方法的效率比较低，那么一些信号就可能会被丢失，例如，以10个拷贝或更少的拷贝表达转录因子的mRNA。蔡龙认为分辨率是目前许多空间方法的一个弱点，而分辨率低将会导致“最终你必须放入一个测序仪”。高通量基因组学技术已经领先一步，但对于现在测序所能做的几乎所有事情，未来空间分析亦可以做到，甚至做得更好。

Evan Macosko是Broad研究所的一名医学科学家，他一直热衷于利用基因组学对细胞和组织进行新的测量。他在哈佛医学院Steve McCarroll的实验室做博士后时，参与开发了Drop-seq。使用Drop-seq，只需要一天时间就可以制备数千个测序文库。该技术利用微流控装置，当细胞穿过狭窄的通道后，最终被封装在带有磁珠的液滴中，每个磁珠都带有一段由12个碱基对构成的独特的寡核苷酸序列；接着细胞在液滴中裂解，mRNA被磁珠上的寡核苷酸序列标记，然后逆转录成可用来测序的cDNA。Macosko还和Fei Chen一起开发了Slide-seq技术。Fei Chen是扩展显微镜的共同发明人。Macosko说，Slide-seq技术利用了“DNA标签策略和其他一些技巧”。随着smFISH的进化，Slide-seq成为了他实验室里一个主要的工具。多重原位杂交策略是非常有用的，但是它们很耗时并且对技术有一定的要求。Macosko说：“这不是传统的分子生物学或细胞生物学实验室可以立即建立起来的东西”。他寻求了一种利用基因组实验室中基于Illumina的广泛测序基础设施，在全基因组范围内达得细胞或近细胞水平分辨率的方法。他和他的团队应用了Drop-seq的标记方案，从50微米的磁珠开始，然后转变成了10微米的磁珠。Chen实验室的Sam Rodriques和Macosko实验室的Robert Stickels发现了如何将磁珠单分子层排列成二维阵列，并开发了一种将RNA转移到磁珠上的试验方案。Macosko说，这“说起来容易做起来难”。他说，Slide-seq的输出接近单细胞分析的结果，这使得使用单细胞计算工具成为可能，“就像磁珠是单细胞一样”。他们使用了velocyto和Monocle等单细胞分析工具。在其他项目中，他们已经使用这种方法来研究晶状体和胚胎皮层的发育。他说低分辨率的空间技术每个像素有太多的细胞，这使得去卷积更加困难。由于Slide-seq使用了磁珠，“我们可以继续让磁珠更小，分辨率更高”。该团队一直在研究提高这种方法的效率。他说，Slide-seq v2的mRNA捕获效率接近于scRNA-seq技术。效率很重要，因为对于罕见的转录本来说，需要足够的信息才能准确地将它们分配到特定的位置。但是目前关于Slide-seq商业化的讨论还处于早期阶段。

庄小威开发了超分辨率显微镜方法STORM。单细胞基因组学使她想到了融合基因组学和成像技术。

图片来源：Harvard University

空间计算

约翰霍普金斯大学的计算癌症生物学家Elana Fertig说：“事实上，空间组学技术不能完美地解析每个细胞，对此我可以接受”。尽管在理想的情况下，她希望能够达到单细胞的分辨率。她的工作是研究肿瘤的异质性，她的项目是评估T细胞对肿瘤的渗透力，空间技术可以帮助她解决这一问题。该实验室以多组学为中心，整合来自不同组学的数据，并使用来自多种空间分析方法的数据。她发现10x Genomics的Visium技术比FISH更容易获得。分子的差异性可以定义肿瘤类型，但一个类型中的肿瘤可能有很大差异。她说：“细胞类型并不是二元的”。她想知道到目前为止，流式细胞术是否已经影响了细胞类型识别。观察带有许多细胞标志物的样本可能会得到一个连续的细胞身份。对于这项工作，科学团队旨在迭代发现、开发数据分析和可视化方法领域设计出相应的计算方法，这个工作显得尤其重要。Fertig实验室是美国国家癌症研究所癌症研究信息学技术项目的一部分，该项目旨在构建解析高维组学数据的框架，而高维组学数据将越来越多地包括空间数据。由于每个细胞有更多的标志物，数据的高维增加了数据解析的挑战。她说：“我认为这是空间领域目前所面临的挑战”。为了整合成像和单细胞数据进行空间转录分析，她和她的团队将迁移学习应用于叠加基因相关特征并进行降维。

Macosko预见了计算开发的一个阶段，该阶段将围绕寻找空间变异基因或寻找利用空间信息的轨迹。Shendure说，尽管付出了很多努力，但管理数据和平台集成仍然是一个巨大的挑战。每一个实验都会产生大量的数据，研究人员需要决定哪些数据需要保存，哪些数据需要丢弃，以及不想偏离基因组学中公开数据共享的原则。

空间转录组学揭示了在小鼠等基于干细胞的发育模型中表达的体发生标志物。

图片来源：Hubrecht Inst.A. van Oudenaarden.

数据处理

在艾伦研究所，像大脑细胞分类这样的大型项目就像处理大型数据集一样司空见惯。艾伦研究所的Tasic说，当观察单细胞和空间转录组数据时，能够发现每个细胞有成千上万的特性，并且能够很快地达到标准分析的阈值，这让她们感到十分惊讶。她说：“数据矩阵变得难以管理”。她们也与非生物学处理大规模数据矩阵的人合作。她说，未来的计算之路既令人生畏又令人兴奋。她在研究生院时关于测量所有单细胞的所有基因的梦想开始实现。除了数据大小和维度之外，她和她的团队还致力于整合和纠正批次效应。即使使用相同的模式捕获的数据也可能在批次处理之间略有不同，所以必须进行标准化。为了整合影像、测序和电生理学等多种模式，她和她的团队构建了聚类方法，并借鉴不同类型的机器学习方法。

空间技术可以揭示组织中复杂的细胞类型混合物–这是小鼠大脑的嗅球。

图片来源：Cai lab, Caltech, I. Strazhnik Adapted with permission from ref.⁵, Springer Nature.

Van Oudenaarden说，确实存在很多机会可以通过计算将scRNA-seq与空间组信息结合，从而能够在空间中定位单个细胞，进而生成可供参考的图谱以及相关工具。他对在不使用图谱的情况下利用杂交参考数据库重建空间图谱的计算很感兴趣。NovoSpaRc正是其中一种计算方法。它对基因表达在整个组织切片中变化情况进行假设，因此无需图谱就可以进行基因表达制图。Van Oudenaarden认为，我们面临的一个重要问题是如何从组织中获得更多的信息。这些信息可以了解生物信息的核心，即生物的“骨骼”，这将成为一个“更大的难题”。对他来说，单细胞组学与空间技术的结合“确实是一种进行假设的方式”，并需要独立的数据对结果进行验证及确认。

商业需求

Shendure提到，空间组技术拥有悠久的历史，例如Mats Nilsson以及George Church等实验室早在十年前就已经开始进行基因分型或直接在组织切片上进行测序。此外，在过去的一两年里，单细胞领域及其相关技术已经相当成熟并成功转化为应用广泛的商业化产品，这也是空间组技术能够蓬勃发展的部分原因。“尽管如此，商品化仍然是许多研究者面临的挑战之一”。Shendure在谈到现代空间组技术的发展时说道，“大量更优秀的方法仍然是定制的，并只能在一个或少数几个实验室中使用”。目前存在的问题是，其他团队如何更便捷地获得并实施这些方案。曾红葵认为，科学家们首次完成的工作往往既困难又昂贵，但技术的发展能够改变这一点。商业化对于推动单细胞测序的发展至关重要，因此空间组技术也有可能出现这种情况。Tasic这样说，“我非常期待在单细胞水平上发挥作用的空间转录组学的商业化方案的出现”。

10x Genomics研究与开发高级副总裁Michael Schnall-Levin说，空间技术，尤其是原位技术，“可能最先在神经科学领域发展”。其他领域，例如科研人员在发育生物学领域中研究细胞中分子梯度和空间模式，或在癌症研究方面，进行肿瘤异质性以及T细胞浸润研究时都亟需空间组分析。一直在公司工作的Schnall-Levin说，自从公司成立以来，团队就十分重视微流体技术、长序列的读取方法以及单细胞和空间组分析。最初与Spatial Transcriptomics达成共同营销协议的方案在2018年被公司收购。Visium尚达不到单细胞分辨率。尽管公司正在努力实现这一目标，但“我们之间的差距很大”。Schnall-Levin介绍道，他和他的团队还专注于研究原位高分辨率分析。该公司收购了哈佛医学院教会实验室的衍生产品ReadCoor，以及斯德哥尔摩大学实验室和生命科学实验室研究员Mats Nilsson的衍生产品Cartana。Cartana使用与目标基因的mRNA杂交的探针，然后通过滚环扩增RNA，以准备进行测序。ReadCoor也使用标签和探针进行荧光原位RNA测序和蛋白质检测。Schnall-Levin说，Cartana为10x Genomics公司带来了可以快速发展积累的核心：一组专利技术、化学试剂以及具有专业技术的科学家。ReadCoor为研究者们带来了 “基础技术”：专利和技术开发成果，因为制造该公司仪器的团队在某些“特殊”约束条件下工作。为10x Genomics提供咨询的Shernaz Daver说，10x Genomics共拥有935项专利，从这两家公司就获得了110项专利。Schnall-Levin说，这些技术可以将分子精确定位到亚细胞水平的位置。目前，他们测量的范围是数百个基因的集合，但是他认为，显然“还有增长的空间”。ReadCoor和Cartana的方法是对Visium基础技术的补充，因此在并购后，公司仍与原实验室保持学术上的联系，因为他们能够对关键知识进行指导。

2019年，NanoString开始销售其用于空间组分析的仪器GeoMx。该设备早期已经在研究者中进行测试。一些实验室使用机器原型进行试验，其他实验室则需要将样品发送到公司的西雅图总部，并远程使用该仪器。早期，GeoMx可以捕获约100个mRNA，NanoString总裁兼首席执行官Brad Gray说，现在这个数字已经超过22,000，展现该领域极快的发展速度。Gary说，NanoString是西雅图系统生物学研究所的衍生产品，它采用了光学分学标签技术，而现在，它完全是关于空间分析的。研发部首席科学家兼高级副总裁裁Joe Beechem说，GeoMx平台的早期使用者主要是进行肿瘤免疫学方面的研究。例如，有实验室试图研究T细胞是否是在肿瘤周围而不是进入肿瘤内部发挥作用。有一天，就在发表演讲之前，他在餐巾纸上写下了公司的寡核苷酸标签如何在空间上分辨组织并在第二代测序仪上进行读数记录的。该公司先前已经开发出一种，通过可被光裂解的小分子连接片段，将DNA标签添加到抗体上的方法。他的想法是在组织玻片上铺开这些连接片段和标签，它们可捕获mRNA，之后显微镜对组织进行拍照，发出的光可把DNA标签解离下来。然后对mRNA和DNA标签进行测序。正如Gray所解释的那样，他们的客户长期以来一直要求研究全转录组，并期望获得更高的分辨率直至亚细胞区室的方法，这样他们就可以问：“它是存在于细胞表面？是存在于细胞核中？还是附着在某些细胞器上？”。他认为，市场将分为两种工具类别：一类是，以NanoString公司的GeoMx数字化空间分析系统和10x Genomics公司的Visium空间基因表达为代表，可高通量、弹性选择感兴趣区域的分析系统；另一类是，具有细胞和亚细胞分辨率，可能不会覆盖全转录组，但一次会覆盖数千个基因的分析系统。NanoString刚刚推出了具有单细胞分辨率的GeoMx数字化空间分析系统。NanoString新技术也使用了可光裂解的标签，可对包括福尔马林固定石蜡包埋的组织在内的组织进行基因表达谱分析。应用方面，它可用于研究死于COVID-19的人尸检样本的空间信息。Beechem说，有了这种技术，研究人员将拥有集合以往所有分子工具的全部力量。

华大Stereo-Seq同时实现“亚细胞分辨率”和“厘米级全景视场”

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.01.17.427004v1

华大生命科学研究院正在开发一种用于解析基因空间表达分析的高分辨率方法。华大集团首席执行官、华大生命科学研究院院长徐讯表示，该想法是在单细胞测序和细胞在组织中位置的空间分析之间架起一座桥梁，它们将共同塑造功能和结构的研究。他关注了其他公司在这一领域的活动，相信华大的方法将具有最高的分辨率。徐讯说，这种方法在每个细胞中捕获数百个数据点。它以纳米阵列的形式封装在硅芯片上，这种纳米阵列采用了半导体工业的光刻技术。华大基因使用这种方法来解析DNA-蛋白质的相互作用，华大科学家陈奥说，他和他的同事正在研究将细胞或组织嵌入这些芯片的方法，以产生高分辨率的空间解析数据。硅芯片阵列的方形隔室每个都有圆形区域，每个区域都包含带有标签的DNA纳米球，可以用传统的广域成像技术进行解析。DNA纳米球是由捕获的转录本制成的环化cDNA束，其中包括可用于华大测序平台的引物和接头。每个标签的读出均以阵列上的特定间距作为其空间地址。徐讯说，芯片上的轨迹线给出了每个细胞的测量坐标。这种空间方法借鉴了华大从Complete Genomics公司收购的技术，预计将于2021年发布。华大已经制造出了用于小鼠大脑空间分析的芯片，每个纳米球bin（可以理解为分辨率）大约有2,000-4,000个基因转录本。该系统最终可以帮助研究人员建立人类和模式生物参考组织图谱；他们也可以使用这种空间技术来评估遗传变异如何影响组织功能（例如在癌症中），或者将其用于跨物种比较方法（例如基于组织的器官进化和适应性研究）。

涉及空间领域的公司活跃于软件的开发。10x Genomics公司研发高级副总裁Schnall-Levin的团队致力于开源软件的开发，他说，信息学一直是公司的核心部分，研究人员可以将其算法和工具添加到10x Genomics分析流程中。正如徐讯所解释的那样，他们的团队致力于开发交互式可视化工具“为人们提供组织的真实视图”。NanoString公司的Gray说：“Joe最大的研发部门现在是软件部门”。该公司的程序员比分子生物学家和工程师还多。

借助MERFISH，庄小威实验室捕获了小鼠大脑单个细胞中10050个基因的表达。来自不同基因的RNA分子以不同的颜色显示。

图片来源：X. Zhuang laboratory, Harvard U./HHMI

图谱发展

空间分析对于建立大脑起始细胞-普查网（BICCN）至关重要。BICCN是一个由美国国立卫生研究院（NIH）资助的项目，该项目由许多实验室共同合作，绘制人类、小鼠和非人灵长类动物的大脑参考图谱。它涉及成像、电生理学和诸如转录组学和表观基因组学的分子遗传学分析。艾伦小鼠大脑图谱的研究始于所有小鼠基因的原位表达谱分析，以显示解剖结构和空间基因表达模式。指导BICCN小鼠全脑图谱项目的曾红葵说，它是一个已被广泛使用的参考数据库。Tasic说，该团队正在建立小鼠和人脑中细胞类型的“周期性系统”。她领导了一个BICCN项目，该项目涉及用于全脑标记的特定细胞类型工具的开发，以及以特定细胞类型方式研究神经回路的方法。研究团队很快将拥有特定细胞类型的参考图谱，他们可以在上面绘制自己的发现。BICCN团队最近发表了一份哺乳动物初级运动皮层的多模态细胞普查和图谱⁸。曾红葵说，BICCN第二阶段已经开始。在这些新项目中，有一些致力于细胞类型靶向工具开发的项目，这些工具可以应用空间和分子信息，扰动细胞并且表征其在神经回路和行为中的作用。

艾伦脑科学研究所所长曾红葵（左）和艾伦研究所Bosiljka Tasic。

图片来源：Allen Institute for Brain Science

对于最近的小鼠初级运动皮层图谱，研究小组指出，单细胞基因组已经席卷了包括神经系统科学在内的整个生物学领域，并且催生了从实验室能够对表型进行分类和描述，转变为具有机制和解释性的分子遗传框架的脑组织细胞基础，其中包括完整的转录组。为了通过转录组细胞类型映射小鼠初级运动皮层中300,000多个细胞的空间结构，他们选择了庄小威的MERFISH9。他们将MERFISH与其他方法结合使用，例如Patch-seq，通过电生理学测量细胞，然后进行测序。他们分析并比较了小鼠、狨猴和人类转录组细胞类型。之后，他们选择了超过250个基因的一组数据进行成像，然后通过单细胞表达谱进行聚类，发现与单核和单细胞RNA-seq鉴定的聚类具有“极好的对应性”。这使得他们能够辨别细胞类型的空间分布，并获得对传统定义皮层进行了改进的皮层的视图。他们还指出了沿内侧、外侧和前后轴的空间分布。有时会爆发出关于大脑制图的分歧，但是Tasic认为，先进的技术将慢慢帮助解决这些分歧，而这些分歧有时是源于实验时使用了不同的方法。有了通用的坐标系，分歧就可以转移到例如关于功能的必要性讨论上。曾红葵说：“在很多情况下，一个基因通常不足以鉴定一种细胞类型”。Tasic针对细胞类型方面说：“通常是不存在非黑即白这种情况的”，“有很多表达水平不同的基因，它们共同构成了一个真正的细胞”。曾红葵说，检测单个细胞中表达的数千个基因的能力“已经极大地改变了这一领域”。空间转录组学则又增加了其丰富性，研究人员可以通过一种空间定位的方式能够观察到细胞内的许多基因。

庄小威很高兴MERFISH被用于构建大脑图谱。她说：“我个人对大脑非常着迷。” 在MERFISH技术，RNA在杂交过程中被赋予标签。非荧光靶向探针与mRNA结合，荧光读数探针与靶向探针杂交。读出的序列在每个mRNA中产生不同的标签。连续几轮的杂交，标签和纠错机制能够使其捕获很多基因。庄小威说，多轮杂交所面临的挑战是错误积累。每个回合各自的错误率很小，但是错误会累积并变得很大，这有可能最终导致基因错误识别。庄小威说，smFISH具有很高的准确性。但这仅是一次测量，而不是累积误差的连续测量。在她和她的团队开发MERFISH的过程中，她们致力于成像，内置错误校正以及一种能够在数千种RNA转录组范围内传递结果的方法。该方法实现了80％的检测效率。在一个单独的基于BICCN的项目中，庄小威和她的团队使用MERFISH分析了小鼠下丘脑前视区中的一百万个细胞。在先前未生育幼崽的雌性小鼠的大脑中，暴露于幼崽环境中会激活一个神经元，该神经元在小鼠雌性和雄性父母中也同样被激活，而在没有生过幼仔的雄性中并不活跃。她和她的团队还运用MERFISH来表征亚细胞的空间结构，以揭示不同细胞区室中的RNA以及染色质的组织方式¹⁰。她说，最终这项工作展示了“3D基因组和转录组是如何相互关联的”。她与哈佛医学院的研究员David Walt和Jeffrey Moffitt一起创立了一家名为Vizgen的公司，致力于将MERFISH商业化。

空间未来

作为显微学家，庄小威很高兴看到成像和单细胞基因组分析领域越来越近。KTH的Ståhl十分期待高分辨率的空间转录组学。他说：“也许像10微米那样的分辨率是最佳选择”，这样每个像素就可以提供足够多的数据。许多现有的方法引领着单细胞RNA测序发展，同时也为定量的基因表达提供了最高的灵敏度读数。不过希望有一天，对于整个转录组范围的单细胞空间分析“我们可以完全摆脱单细胞测序”。

Shendure说，空间信息显然很重要，“而且我们还处于人们可以想象出技术最终走向的早期阶段”。Macosko说，令人兴奋的是，空间转录组技术是“年度技术”，“我认为这仅仅是个开始”。为了研究感兴趣的问题，人们可能会使用空间分析领域中诸多工具和技术中的几种。他说，标准、度量和基准将帮助空间领域，就像它们在帮助单细胞基因组学领域一样。

Macosko说，从单分子FISH和单细胞基因组分析开始，已经形成了将基因组学的大规模生成技术引入细胞生物学和组织生物学的方法，这将为思维和技术的发展奠定基础。研究人员将能够在空间背景下对基因表达进行更细致的研究，例如酶促过程以及细胞之间、基因之间以及蛋白质之间的相互作用。他说，他们将能够对空间中感兴趣的事物进行标记标签和定位，这将改变细胞生物学、病理学以及组织学的实践方式。

曾红葵看到了很多未来的机会。她说：“在很多情况下，这些技术还不是很完美” ，“我们希望有更多更好的东西，以扩大技术规模，并能够常规高效地测量数千个基因”。Tasic说，空间方法将成为标准方法。有一天，人们将利用组织获得空间解析的单细胞遗传信息。人们对该领域论文的普遍反应可能是：“哦，您没有测量所有基因？为什么不呢？”。

参考文献：

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5.Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M. & Cai, L. Nat. Methods 11, 360–361 (2014).

6.Eng, C.-H. L. et al. Nature 568, 235–239 (2019).

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